寒地水稻紋枯病抗性鑒定指標的灰色關聯分析

李修平 馬文東 常瑋

摘要[目的]明確寒地水稻紋枯病抗性鑒定的調查指標及鑒定時期。[方法]利用苗期鑒定法和成株期牙簽嵌入法分別于分蘗末期和抽穗期進行接種，并在苗期采用單株病情指數，成株期采用病級、相對病斑長度、病斑長度和絕對病斑高度為調查指標，進行抗性鑒定。[結果]分蘗末期接種的3次調查中，病級、絕對病斑高度與抽穗期第3次調查的絕對病斑長度和病級的灰色關聯度呈上升趨勢，且分蘗末期接種的第3次調查中這2個指標與對照指標的灰色相關度分別為0.891 2、0.888 6和0.911 1、0.903 0。這2個指標可作為抗性鑒定重要參考指標。苗期鑒定的單株病情指數與2個對照指標的灰色相關度分別為0.746 1和0.787 9，表明苗期鑒定的調查指標與成株期鑒定的結果具有一定的相關性。[結論]成株期牙簽嵌入法在分蘗末期和抽穗期接種，接種后第36天調查的病級和絕對病斑高度可作為抗性鑒定和遺傳分析的重要指標。苗期鑒定的單株病級指數與成株期鑒定結果具有一定的灰色關聯度。

關鍵詞 寒地水稻；紋枯病；抗性鑒定指標；灰色關聯分析

中圖分類號 S435.11 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）03-0174-03

Abstract[Objective] The purpose of this study was to clear scientific and reliable investigation index and identification period for rice sheath blight resistance identification in cold region. [Method] The resistance identification was carried out in seedling stage and adult plant stage， toothpick embedding method was used in adult plant identification in the stage of late tillering stage and heading stage； the investigation indexes were seedling disease index in seedling stage and disease rank， absolute disease height， relative disease length and disease length in adult plant stage.[Result] The three investigation which were inoculated at late tillering stage， the grey correlation among disease rank， absolute disease height， relative disease length and disease length with absolute disease height， disease rank which were investigated in the third investigation at heading stage inoculation were increased， and the grey correlation in the third investigation with the check index were 0.891 2， 0.888 6 and 0.911 1， 0.903 0 respectively. And the two indexes could be used as important indexes for resistance identification. The grey correlation among the seeding disease index at seeding identification with two check indexes were 0.746 1 and 0.787 9 respectively， which showed that the investigation index in seeding identification was associated with that of adult plant stage.[Conclusion] The disease rank and absolute disease height of thirtysixth days after inoculation in adult plant identification could be used as important indexes for resistance identification and genetic analysis. There was a certain degree of grey correlation between seedling disease index in seedling stage and the results in adult plant identification.

Key words Rice in cold region；Sheath blight；Resistance identification index；Grey correlation analysis

水稻紋枯病是水稻生產中重要病害之一，培育抗病品種是最經濟有效方式。水稻紋枯病的抗性鑒定成為水稻紋枯病抗性育種的首要任務。潘學彪等[1-5]對水稻紋枯病的抗性鑒定方法和指標進行了大量研究。其抗性鑒定方法按接種時期分為苗期鑒定和成株期鑒定，成株期接種又分為分蘗末期和抽穗期等；按照接種方式可分為撒施法[6]、外貼法[3]、注射法[7]、捆扎法[8]、牙簽嵌入法[3]，其中牙簽嵌入法已被廣泛應用[9-12]。調查指標常用的有Rush等[6]提出的0～9級病級調查體系、左示敏等[5]提出的16級葉鞘位調查標準、潘學彪等[13]提出的絕對病斑高度和相對病斑長度等。

寒地水稻由于施肥水平的提高以及紋枯病病菌寄主廣泛、抗源少等原因，致使寒地水稻紋枯病發病日益嚴重，成為寒地水稻生產的上升性病害之一[14]。已有藥劑防治效果不佳且造成環境污染、增加農民生產成本。因此，了解寒地水稻種質資源抗性情況及培育適合寒地種植的抗性品種已成為寒地水稻紋枯病抗性育種亟待解決的問題。寒地水稻抗性鑒定體系和發病規律研究較少[15]，明確適合寒地水稻紋枯病抗性鑒定的調查指標和時期，對寒地水稻紋枯病抗性育種及遺傳分析具有重要意義。

灰色關聯分析是根據變量序列曲線幾何性狀的相似程度來判斷多變量間緊密關系的統計分析方法[16]。筆者采用灰色關聯分析了水稻紋枯病抗性鑒定指標，以期為寒地水稻紋枯病抗性鑒定和遺傳分析提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種質資源材料。

收集192份寒地水稻品種（系）及育種材料，包括不同生育期主栽品種及優良育種材料，田間管理同大田，每個品種種植2行，行長1 m；旱育秧，插秧規格為30 cm×10 cm。

1.1.2 水稻紋枯病病菌。

2014年采集黑龍江省農業科學院佳木斯水稻研究所紋枯病發病植株，進行分離培養保存，參照彭紹裘等[17]的研究方法。

1.2 方法

1.2.1 水稻紋枯病抗病鑒定方法。

1.2.1.1 苗期鑒定。

（1）稻谷接種物培養基的制備。

將稻殼和稻粒以2∶1的比例混合，用清水浸泡 24 h，然后濾去水分（以不滴水為宜），裝入三角瓶，將稻谷混和物裝入三角瓶的 2/3處。用外套牛皮紙的脫脂棉塞塞住三角瓶口，121 ℃高壓滅菌30 min。滅菌后的稻谷接種物應以稻谷表面濕潤但不結團為宜。

（2）接種方法。

水稻紋枯病菌接種至 PDA 培養基上培養2～3 d，切取紋枯病菌菌絲塊5～10塊，接入裝有稻谷接種物培養基的三角瓶中，25 ℃暗培養 10～15 d，當三角瓶長滿初期白色菌絲，后期深褐色的菌核時即可用于接種。暗培養期間每 2 d要輕晃三角瓶使菌絲體均勻分布在接種物上。

將鑒定材料浸種，播種，每品種3次重復，每重復種植 10 株苗。小苗于 3.1～3.5 葉期，采用稻谷接種物接種，在每株苗的假莖兩側分別放置 1 粒稻谷接種物，注意接種物應需貼近葉鞘，以保證發病。

在溫室中利用防水塑料布鋪設長槽，將接種后的營養缽均勻擺放于其間，在槽內注水以保證水分供給和棚內濕度，在槽外側加蓋鐵架，鐵架外覆蓋薄膜，以保證溫度和濕度，在日光強烈時加蓋遮陽網，使接種材料處于溫度25～30 ℃、相對濕度80%～85%的“微室”中。以lemont為對照，在其充分發病后立即調查。調查指標為單株病情指數，公式為單株病情指數=病斑高度/植株高度×9級。

1.2.1.2 成株期鑒定。

采用嵌入法分別于分蘗末期和抽穗期進行接種鑒定。

（1）接種方法。

參照潘學彪等[3]于1997年提出的牙簽嵌入法，將木質牙簽剪成長0.8～1.0 cm的小段，鋪于培養皿的底部，加入適量PDA培養基，覆蓋牙簽厚度以0.5～1.0 cm為宜，121 ℃高壓滅菌15 min，接種。在25 ℃下培養3～5 d，待菌絲密集地布滿培養基時，用于田間接種，每個品種接種3株，每稻叢接種3個莖桿，并掛標簽。用鑷子將短牙簽自上向下嵌入接種莖干第2～3葉鞘，由于這2個葉鞘不再伸長，并且接種后葉鞘抱莖狀態未被改變，故植株呈自然狀態。

（2）調查時期及指標。

接種15 d后，每隔7 d調查1次，共調查3次。調查指標為病級、病斑長度、病斑高度、株高、相對病斑長度和絕對病斑高度。

病級參考Rush提出的9級標準并由潘學彪研究組修改的調查標準[5]；

病斑長度為以病斑變色部分上下界限間長度為標準，莖稈上所有病斑長度的加和（cm）；

病斑高度為病斑上界至土表的距離（cm）；

株高為穗頂到土表的距離（cm）；

相對病斑長度=病斑長度/株高×100%；

絕對病斑高度=病斑高度/株高×100 %。

1.2.2 灰度關聯分析。

將抽穗期接種3次調查和分蘗期接種3次調查的病級、病斑長度、相對病斑長度和絕對病斑高度視為一個灰色系統，根據各指標與抗病性之間的關系，分別以抽穗期第3次調查的病級和絕對病斑高度作為參考數列（X0），試驗組指標所構成的數列作為比較數列（Xi），根據灰色系統理論先將各考察性狀進行無量綱化處理，并按照公式（1）將原始數據標準化：

2 結果與分析

2.1 水稻紋枯病各調查指標差異性分析

由表1可知，病級數、絕對病斑高度、相對病斑長度及病斑長度4個調查指標在分蘗末期的3次調查和抽穗期第3次調查中差異顯著，該4個調查指標呈現不斷加重的趨勢，不論是分蘗末期還是抽穗期接種第3次調查（即接種后第36天）發病情況最重，變異系數最大。分蘗末期和抽穗期第3次調查的結果可作為抗性鑒定的參照指標。

2.2 水稻紋枯病調查指標灰度關聯分析

由表2可知，抽穗期第3次調查指標病級、相對病斑長度、病斑長度與其絕對病斑高度灰色關聯度分別為0.900 8、0.915 7、0.956 1；絕對病斑高度、相對病斑長度、病斑長度與其病級的灰色關聯度分別為0.936 8、0.908 1、0.904 6。分蘗末期接種的3次調查中，病級、絕對病斑高度與抽穗期第3次調查的絕對病斑長度和病級的灰色關聯度呈上升趨勢，且分蘗末期接種的第3次調查中其灰色相關度分別為0.891 2、0.888 6和0.911 1、0.903 0。結果表明，分蘗末期第3次調查指標病級和絕對病斑高度可作為重要參考指標。苗期鑒定的單株病情指數與抽穗期接種的絕對病斑高度和病級的灰色相關度分別為0.746 1和0.787 9，表明苗期鑒定的調查指標與成株期鑒定的結果具有一定的相關性。

3 結論與討論

建立和完善科學的紋枯病接種鑒定體系，無論是從植物保護的角度還是抗病育種的角度都是首要進行的工作。目前，人們對南方稻區水稻紋枯病的抗性鑒定體系開展了大量研究[1-5]，但水稻紋枯病的發病與其小環境的氣候條件有密切關系，關于寒地稻作區的發病規律有少量報道[14-15]，探索和改良出適合寒地水稻紋枯病抗性鑒定的方法和評價指標對于寒地水稻紋枯病的抗性育種和分子機理研究具有重要意義。

該研究根據寒地氣溫條件將苗期鑒定法進行了改善，在溫室內建立大型水槽，并將試驗材料種植于營養缽中，在水槽中注水保證秧苗的需水以及濕度的提供；同時在水槽外加蓋鐵架，在鐵架上覆蓋塑料薄膜保溫，中午強光下覆蓋遮陽網，保證水稻紋枯病發病的最適溫度及濕度。該方法簡單易行、成本低，適用于大量試驗材料的鑒定。

為探索出最佳的成株期接種的調查時期，該研究在接種后15 d每隔7 d進行一次調查，調查病級、絕對病斑高度、相對病斑長度和病斑長度，第3次調查時各試驗材料發病均勻，能夠反映出各試驗材料間差異。灰色關聯分析能夠客觀地反映出各調查指標間關系，從調查指標來看，絕對病斑高度、相對病斑長度和病斑長度主觀性誤差更小，其數值變化更適于遺傳定位研究，病級可作為抗性鑒定的可靠、快速調查指標。

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