桃紅肉性狀分子標記的有效性檢測

丁體玉 曹珂 趙佩

摘要 [目的]檢測桃紅肉性狀分子標記在自然群體上應用的有效性。[方法]以109份桃種質為試材，檢測位于LG4上的2個SNPs標記SNP_IGA_386619和SNP_IGA_387198以及LG5和LG3上的SSR分子標記WPS23和UDP96-008的分型與種質果肉紅色素的相關性。[結果]秩和檢驗表明，標記SNP_IGA_386619的3種分型與種質紅色素多少的相關性達到顯著水平（P=0.007<0.05）；而標記SNP_IGA_387198、WPS23、UDP96-008的分型結果與紅色素多少未達到顯著相關，P值分別為0.561，0.865和0.079。[結論]SNP_IGA_386619標記可用于紅肉桃的分子標記輔助育種，但依據分型結果判定自然群體紅色素的多少仍存在準確性較低的問題，尚需繼續開發更加準確的廣適性紅肉性狀分子標記，加速其分子輔助育種進程。

關鍵詞 桃；紅色素；秩和檢驗；分子標記輔助育種

中圖分類號 S662.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）03-0161-06

Abstract[Objective] To detect the effectiveness of molecular markers associated with bloodflesh in peach applied in nature population. [Mehtod]Two SNPs （SNP_IGA_386619 and SNP_IGA_387198 on peach LG4） and two SSR markers （WPS23 on peach LG5 and UDP 96-008 on peach LG3） were used to analyze the relationship between their genotypes and the content of red pigment in 109 peach germplasms. [Result]Ranksum test results showed that there had obvious correlation between the genotypes of SNP_IGA_386619 and the content of red pigment in 109 peach germplasms （P=0.007<0.05）. However，the correlation between the genotype of SNP_IGA_387198，WPS23 UDP96008 and the content of red pigment in fruit showed no significance， the values of P were 0.561，0.865 and 0.079，respectively.[Conclusion]The marker SNP_IGA_386619 can be used for molecular markers assisted breeding bloodflesh peach，but it is difficult to identify bloodflesh peach according to present molecular markers from different peach germplasms. More efforts should make for developing precise molecular marker associated with bloodflesh trait to accelerate the molecularassisted selection in peach.

Key words Peach；Red pigment；Ranksum test；Molecular markers assisted breeding

紅肉桃是我國一種特色的種質資源，類型各異，根據肉色類型可分為環形紅、紫紅、鮮紅和斑紅，其以獨特的感官魅力受到消費者的喜愛。研究表明，花色素苷的積累是桃呈現紅色的主要原因，其主要成分包括矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷[1]，其中以矢車菊素-3-葡萄糖苷含量最高。近年的研究表明，紅肉桃的抗氧化活性可與藍莓等相媲美，食用紅肉桃可以預防多種心腦血管疾病和癌癥，是一種重要的功能性水果[2-4]。

對紅肉桃進行準確的表型評價是紅肉桃育種親本選擇的基礎，而對紅肉性狀遺傳模式的解析又影響到評價方法的準確性，不同研究結果間存在一定差異，如Werner等[5]研究認為‘Harrow Blood是bf（bloodflesh）型的隱性單基因控制的紅肉桃，而Shen等[6]研究認為‘WuYueXian屬于DBF（dominant bloodflesh）控制的單基因顯性遺傳模式的紅肉桃。也有不少研究認為，桃紅肉性狀并不僅是由單基因控制的[7-10]，而且是一個復雜的數量性狀。因此，目前多依據《桃種質資源描述規范與數據標準》[11]，根據桃果實在食用成熟期時果肉中紅色素占全果的比例將桃種質分為無（無紅色素）、少（0<紅色所占比例<1/4）、中（1/4<紅色所占比例<3/4）、多（紅色所占比例≥3/4）4種類型。

近年來，分子標記輔助育種在農作物上的成功應用為果樹分子育種展現了光明的前景。在桃上，為獲得與紅肉性狀緊密連鎖的標記，不少研究者開展了連鎖分析工作。Quilot等[7]利用‘Prunus davidiana clone P1908和‘Summergrand的雜交群體，將紅肉性狀定位在LG3（Linkage group，LG），與簡單重復序列（Simple Sequence Repeats，SSR）標記UDP96-008連鎖。Gillen等[8]利用‘Harrow Blood（‘哈露紅）בOkinawa的F2群體，將紅肉隱性基因bf定位在LG4上端。沈志軍等[9]利用‘Sanguine ChanasבO′Henry的F2群體，構建了包含85個SSR標記和24 個SNP標記的遺傳連鎖圖譜，并將bf基因定位于第4連鎖群的SNP_IGA_386619和 SNP_IGA_387198之間，對應桃基因組的Scaffold_4：4212145～4523432 bp。Zhou等[10]利用‘DHP（‘大紅袍）בSG（‘曙光）的F1群體構建連鎖圖譜，將紅肉顯性基因BL定位在LG5上端，此BL基因（NAC）與SSR標記WPS23連鎖，它能區分‘DHPבSG雜交后代的紅肉單株和非紅肉單株。

由于不同研究者利用的遺傳群體不同，得到的標記與性狀連鎖距離的遠近不同，甚至位于不同的染色體，在對這些標記進行應用時，往往在與所定位群體的親本材料類似的紅肉種質上具有較高的表型預測準確性。為了檢測已報道的這些分子標記在大量自然群體中應用時準確性的差異，該研究在連續多年評價種質果實紅色素的基礎上，分析與桃紅肉性狀相關的分子標記SNPIGA386619、SNPIGA387198、WPS23和UDP96008[7，9-10]與果肉中紅色素多少的相關性，探討其應用價值，為加快紅肉桃分子育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用109份桃種質來自國家果樹種質鄭州桃資源圃，種質名稱見表1。2015年9月取桃新梢嫩葉，帶回實驗室裝至2 mL離心管內，液氮速凍，-80 ℃保存備用。為正確評價種質表型數據，依據《桃種質資源描述規范與數據標準》[11]和課題組多年的經驗，首先將109份種質分為紅肉桃和非紅肉桃，其中紅肉桃種質有8份，紅色素評價為極多，非紅肉桃種質紅色素評價為多、中、少、無，分別有10、18、39、34份種質（表1）。

1.2 種質葉片DNA的提取和PCR擴增

采用上海生工植物DNA提取試劑盒（Sangon，上海）提取桃幼嫩葉片的DNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，核酸蛋白分析儀測定DNA濃度，超純水稀釋至50 ng/μL，-20 ℃保存備用。

已報道的與紅肉性狀相關的分子標記所用引物序列信息見表2。其中用于鑒定SNP的引物由金唯智（蘇州）生物科技有限公司合成，進行SSR標記擴增所需的FAM熒光引物由北京閱微基因技術有限公司合成。

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）體系為30 μL，包括75 ng的基因組DNA，10×Ex Taq Buffer（Mg2+plus），2.5 mmol/L的dNTPs，TaKaRa Ex Taq（5 U/uL），正向引物和反向引物各10 μmol/L。PCR程序如下：94 ℃4 min；94 ℃45 s、退火30 s，72 ℃45 s，36個循環；72 ℃10 min。

1.3 基因分型檢測

對于SNP標記，首先利用上下游引物進行PCR擴增，產物送至北京六合華大基因科技有限公司進行Sanger測序，Chromas Pro 2.33統計目標種質SNPs位點的分型結果。SSR標記的分型則由實驗室進行PCR后，將產物送至北京閱微基因技術有限公司，利用ABI 3730xl測序儀進行毛細管電泳，根據電泳結果判斷條帶大小。

1.4 數據統計分析

Excel 2010統計數據并進行整理，SPSS 19.0軟件對數據做非參數統計的秩和檢驗（Kruskal-Wallis法）[12]。

2 結果與分析

2.1 標記SNP_IGA_386619、SNP_IGA_387198的分型檢測

利用定位于LG4上的標記SNP_IGA_386619和SNP_IGA_387198[9]的引物在供試種質中進行擴增，產物進行Sanger測序以檢測目標條帶的SNP型。其中標記SNP_IGA_386619在109份種質的基因分型為T/T、T/C和C/C（表3），具體分型結果見表1。在該研究中，由于果實中紅色素含量的分類是有等級順序的（極多、多、中、少、無），因此需采用單向有序列表的秩和檢驗的統計方法分析基因型與表型的相關性。由表3可知，對于標記SNP_IGA_386619，秩和檢驗得到Hc=10.060，P=0.007，小于閾值0.05，據此認為此標記的3種分型對種質紅色素多少的區分達到顯著水平。

SNP_IGA_387198標記對109份種質的分型分別為T/T、T/C、C/C（表4），具體分型結果見表1。對表4的數據用秩和檢驗得Hc=1.156，P=0.561>0.05，即該標記的3種分型與種質紅色素多少的相關性未達到顯著水平。

2.2 標記WPS23、UDP96-008的分型檢測

在供試的109份種質中，WPS23標記僅在金塔油蟠桃未擴增出條帶，其他種質均有擴增，且發現種質‘大紅袍和‘曙光的分型分別為143/145、143/147，與Zhou等[10]的研究結果一致。該標記的分型結果可將109份種質分為18類，去除僅有1個種質的分型，主要的分型為10種（表5），具體分型結果見表1。對表5的數據用秩和檢驗得Hc=4.638，P=0.865>0.05，即該標記的10種分型與種質紅色素多少的相關性未達到顯著水平。

UDP96-008標記[7]對青絲和興津油桃沒有擴增出目的條帶，其余種質均有擴增，根據該標記的分型可將109份種質分為23類（去除僅含有1個種質的分型），主要的分型為8種（表6），具體分型結果見表1。對表6的數據用秩和檢驗得Hc=12.731，P=0.079>0.05，表明該標記的8種分型對種質表型的區分未達到顯著水平。

3 結論與討論

目前利用紅肉桃種質資源開展種質創新與新品種選育研究，已經成為國內外桃研究領域的主要方向[13]。但由于桃世代周期長，利用傳統的育種方法培育1個新品種需要10多年的時間，因此分子標記輔助育種就顯得尤為重要[14]。該研究利用前人發掘的4個與桃紅肉性狀相關的分子標記，分析其在不同種質上的有效性，為親本選擇奠定理論基礎，具有一定的積極意義。

表型性狀的準確鑒定是分子標記輔助選擇的前提，但對于判斷紅肉桃的標準一致存在爭議。花色素苷積累是紅肉桃呈現紅色的主要原因[15]。趙玉等[15]通過測定花色素苷的含量，提出紅肉桃的判定標準，即將200 mg/kg定為紅肉桃劃分的臨界點。而在《桃種質資源描述規范與數據標準》[11]中則是通過與參考品種比對的人工觀察法描述種質紅色素的多少，是以紅色素所占比例來分級。該研究在對分子標記的準確性判定時，對種質的分類采用了后者，這是盡量與原始參考文獻，即最初通過連鎖分析鑒定這些分子標記時對種質的紅肉性狀判定方法保持一致。從研究中看出，標記SNP_IGA_387198、WPS23和UDP96-008與種質紅色素多少的分級關系未達到顯著水平，標記SNP_IGA_386619與種質紅色素多少的分級關系達到顯著水平，但是在生產上這樣的分級方法是否仍顯簡單，還需要在后續的試驗中依據種質花色素苷含量的測定，從而更加準確地評價分子標記的適用性。

同時，也應該看到，所鑒定標記之所以不同與其來源的雜交群體親本的花色素苷合成途徑存在差異有關。因此，將這些標記應用在自然群體上時，正確率出現大幅度的降低。如果可根據不同種質花色素苷合成途徑對供試材料進行分群，必然能夠提高所評價標記的通用性。但這要求對不同種質果實發育時期花色素苷的含量和種類進行詳細測定，從而增加研究的工作量。另外，也可以根據系譜關系對雜交群體親本材料進行歸類，然后分別選擇不同的標記在不同的自然群體中進行標記驗證。然而，在實踐中，很難獲知每份材料尤其是地方品種詳細的系譜關系，自然無法對資源圃的種質進行正確分群。因此，在該研究中，在無法按不同來源對種群進行分類的情況下，去討論各標記的適用性，也只能一概而論，即忽視花色素苷合成代謝機制的差異，只考慮紅色素的多少，這是造成某一種質類型特定的標記在檢測其他類型種質時效率較低的客觀原因。

參考文獻

[1] ORAZEM P，STAMPAR F，HUDINA M.Fruit quality of redhaven and royal glorypeach cultivars on seven different rootstocks[J].J Agric Food Chem，2011，59（17）：9394-9401.

[2] KONG J M，CHIA L S，GOH N K，et al.Analysis and biological activities of anthocyanins[J].Phytochemistry，2003，64（5）：923-933.

[3] CEVALLOSCASALS B A，BYRNE D H，OKIE W R，et al.Selecting new peach and plum genotypes rich in phenolic compounds and enhanced functional properties[J].Food chemistry，2006，96（2）：273-280.

[4] VIZZOTTO M，CISNEROSZEVALLOS L，BYRNE D H，et al.Large variation found in the phytochemical and antioxidant activity of peach and plum germplasm[J].Journal of the American society for horticultural science，2007，132（3）：334-340.

[5] WERNER D J，CRELLER M A，CHAPARRO J X.Inheritance of the bloodflesh trait in peach[J].Hort Science，1998，33（7）：1243-1246.

[6] SHEN Z J，CONFOLENT C，LAMBERT P，et al.Characterization and genetic mapping of a new bloodflesh trait controlled by the single dominant locus DBF in peach[J].Tree genetics & genomes，2013，9（6）：1435-1446.

[7] QUILOT B，WU B H，KERVELLA J，et al.QTL analysis of quality traits in an advanced backcross between Prunus persica cultivars and the wild relative species P.davidiana[J].Theor Appl Genet，2004，109（4）：884-897.

[8] GILLEN A M，BLISS F A.Identification and mapping of markers linked to the Mi gene for rootknot nematode resistance in peach[J].J Am Soc Hortic Sci，2005，130（1）：24-33.

[9] 沈志軍.桃初級核心種質、關聯分析和紅肉性狀的圖譜定位[D].南京：南京農業大學，2013.

[10] ZHOU H，WANG K L，WANG H L，et al.Molecular genetics of blood-fleshed peach reveals activation of anthocyanin biosynthesis by NAC transcription factors[J].The plant journal，2015，82（1）：105-121.

[11] 王力榮，朱更瑞.桃種質資源描述規范和數據標準[M].北京：中國農業出版社，2005：60-61.

[12] 楊樹勤.中國醫學百科全書：醫學統計學[M].上海：上海科學技術出版社，1985：135-140，213-214，101-103.

[13] 俞明亮，馬瑞娟，沈志軍，等.紅肉桃研究與利用進展[J].果樹學報，2014，31（5）：959-966.

[14] DURAN C，APPLEBY N，EDWARDS D，et al.Molecular genetic markers：Discovery，applications，data storage and visualisation[J].Curr Bioinform，2009，4（1）：16-27.

[14] 趙秀林，王富榮，徐凌云，等.紅肉桃果實發育過程中色素含量及 PAL 活性的變[J].食品工業科技，2012，33（12）：125-127.

[15] 趙玉，王力榮，曹珂，等.桃果肉花色苷遺傳多樣性及紅肉桃判定指標的探討[J].植物遺傳資源學報，2013，14（1）：167-172.