亞心形扁藻中葉綠素優(yōu)化提取條件

白飛妮 穆富香 楊代宇

摘要[目的]確定亞心形扁藻中葉綠素的優(yōu)化提取條件。[方法]在比較乙醇和丙酮提取亞心形扁藻細(xì)胞中葉綠素效果的基礎(chǔ)上，通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定提取亞心形扁藻中葉綠素的優(yōu)化條件。[結(jié)果]乙醇比丙酮提取效果明顯，乙醇提取亞心形扁藻中葉綠素的優(yōu)化條件是乙醇濃度85%、提取時(shí)間9 min、提取溫度35 ℃，在此優(yōu)化提取條件下，總?cè)~綠素的最高提取量為9.07 mg/g。[結(jié)論]利用乙醇作提取劑可以從亞心形扁藻中提取更多的葉綠素，該結(jié)果可為從其他海洋微藻中提取葉綠素提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 亞心形扁藻；葉綠素；乙醇；提取工藝；優(yōu)化

中圖分類號(hào) S963.21+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）03-0108-03

Abstract[Objective] To determine optimal conditions for extracting chlorophyll from Platymonas subcordiformis. [Method] According to the results of extracting chlorophyll from P. subcordiformis by ethanol and acetone， the optimal condition were obtained by means of orthogonal design. [Result] The extraction effect of ethanol was higher than that of acetone， under the optimized conditions of 85% ethanol， 9 min extraction time and 35℃ extraction temperature， the maximum extraction rate was 9.07 mg/g. [Conclusion] More chlorophyll could be extracted from P. subcordiform by ethanol， the result will provide a basis for manufacturing chlorophyll from other marine microalgae.

Key words Platymonas subcordiformis；Chlorophyll；Ethanol；Extraction process；Optimization

亞心形扁藻（Platymonas subcordiformis）作為一種單細(xì)胞浮游植物，光合作用強(qiáng)，生長速率快，細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)組成全面，在我國沿海各省都有大量的培養(yǎng)，用作魚、蝦、貝類幼體生長必需的活體餌料，投喂幼體后，能夠提高其免疫和抗病能力[1]，亞心形扁藻也是產(chǎn)氫微藻之一，是未來研究清潔能源的一大藻種，具有很好的開發(fā)前景[2]。因此，對(duì)亞心形扁藻所含活性物質(zhì)的研究不僅有望產(chǎn)生具有市場(chǎng)應(yīng)用潛力的新產(chǎn)品，也有利于促進(jìn)微藻資源的充分研究、開發(fā)和利用[3]。亞心形扁藻細(xì)胞外具有一層比較薄的纖維質(zhì)細(xì)胞壁，細(xì)胞內(nèi)有一大型杯狀的色素體，其中含有較多的葉綠素。

葉綠素（Chlorophyll）是浮游植物的主要光合色素，作為表征浮游植物生物量的重要指標(biāo)，在水域環(huán)境生物學(xué)研究及漁業(yè)初級(jí)生產(chǎn)力調(diào)查中被廣泛應(yīng)用[4]，同時(shí)葉綠素在食品、醫(yī)藥和日化工業(yè)中也有重要應(yīng)用[5]，因此從浮游植物中最大限度地提取葉綠素對(duì)表征浮游植物增殖能力和提高葉綠素產(chǎn)量具有重要意義。我國普遍采用的葉綠素提取和測(cè)定方法是丙酮研磨提取法[6]，該提取方法耗時(shí)較長、步驟繁瑣、提取不完全，且提取過程中使用丙酮不利于操作員的身體健康。因此，一些研究人員從細(xì)胞破碎方法、提取時(shí)間、提取液和提取溫度等方面入手對(duì)其加以改進(jìn)，陳宇煒等[7]用乙醇萃取某水域浮游植物中的葉綠素a，其含量為181.44 μg/L，而用丙酮萃取同一水域浮游植物葉綠素a時(shí)，其含量為149.62 μg/L，說明乙醇提取效果明顯高于丙酮。李其雨等[8]比較丙酮、甲醇和乙醇提取真眼點(diǎn)藻類色素的效果發(fā)現(xiàn)，甲醇和乙醇提取時(shí)間短，乙醇的提取效果明顯優(yōu)于甲醇和丙酮。楊代宇等[9]比較丙酮和乙醇提取鹽藻中葉綠素的效果發(fā)現(xiàn)，乙醇比丙酮的提取率高出15.5%，并確定了乙醇提取鹽藻中葉綠素的優(yōu)化條件。

雖然許多研究結(jié)果表明乙醇比丙酮的提取效果好，但因?yàn)槲⒃宸N類不同，細(xì)胞組成和結(jié)構(gòu)有所不同，從微藻中提取葉綠素的具體優(yōu)化條件不同。筆者從亞心形扁藻的實(shí)際應(yīng)用前景考慮，比較乙醇和丙酮提取亞心形扁藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素的效果，并采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定提取亞心形扁藻中葉綠素的優(yōu)化條件，以最大限度地提取扁藻中的葉綠素，促進(jìn)扁藻的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種來源。亞心形扁藻（Platymonas subcordiformis）藻種為大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院海洋微藻生物能源試驗(yàn)組自行分離得出。

1.1.2 儀器。EL204電子天平、80-2離心沉淀機(jī)、LD5-24臺(tái)式離心機(jī)、UV-5200型紫外可見分光光度計(jì)、HH-S恒溫水浴鍋、錐形瓶（5 L）等。

1.1.3 試劑。無水丙酮和無水乙醇均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1

亞心形扁藻培養(yǎng)及藻泥樣品處理。在10個(gè)5 L錐形瓶中分別加入滅菌海水2 500 mL，再分別加入500 mL處在對(duì)數(shù)生長期的亞心形扁藻藻液，再按1‰的比例加入3 mL康威方營養(yǎng)液[10]，在溫度25 ℃、光照強(qiáng)度1 800 lx、光照周期為12 h∶12 h的環(huán)境條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期末期（7 d），離心亞心形扁藻培養(yǎng)液（3 000 r/min，3 min），棄上層清液，藻泥用去離子水清洗3次后，凍融3次，備用。培養(yǎng)過程中，每天搖瓶2次，以促進(jìn)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液混合均勻和內(nèi)部物質(zhì)的交換。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2

丙酮和乙醇的提取效果比較。將離心凍融后的亞心形扁藻藻泥定量后分成4組，按0.15、0.20、0.26、0.38的料液比（g∶mL）分別加入不同體積的95%丙酮和95%乙醇溶液，充分混勻后置于冰箱冷藏12 h，取出后置于離心機(jī)中離心（3 200 r/min，3 min）得上清液。將用丙酮提取的樣品用分光光度計(jì)于波長663 、646 和470 nm 處測(cè)吸光值。將用乙醇提取的樣品用分光光度計(jì)于波長665、649 和470 nm 處測(cè)吸光值。參照王英典等[11]的方法計(jì)算葉綠素濃度，求其平均值，比較葉綠素的提取效果。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。其中丙酮提取葉綠素的計(jì)算公式為（1）～（3），乙醇提取葉綠素的計(jì)算公式為（4）～（6）。

1.2.3

提取條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)。影響提取劑提取微藻中葉綠素的條件有提取溫度、提取時(shí)間和料液比[12]。按照“1.2.2”確定有效提取亞心形扁藻中葉綠素的提取劑后，參照楊代宇等[9]提取鹽藻中葉綠素的優(yōu)化試驗(yàn)條件，進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)（表1）。

試驗(yàn)時(shí)先設(shè)定恒溫水浴鍋的溫度，并將提取劑放入其中恒溫。按照表1分別取0.150 0 g藻泥加入10 mL不同濃度的乙醇溶液，在對(duì)應(yīng)的提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行試驗(yàn)。按照“1.2.2”的方法離心，測(cè)定上清液吸光度值，按照公式（4）～（7）計(jì)算葉綠素濃度和提取量。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙酮和乙醇提取葉綠素效果的比較

由圖1可知，當(dāng)藻泥質(zhì)量與提取劑的體積比相同時(shí)，乙醇提取量均大于丙酮提取量，而在同一提取劑中，提取量從大到小依次為葉綠素a、葉綠素b、葉綠素c。隨著藻泥質(zhì)量與提取劑體積比的增大，葉綠素a的提取量明顯上升，當(dāng)藻泥質(zhì)量與提取劑體積比≥0.26（g∶mL）時(shí)，葉綠素a和c的提取量基本不變，說明一定量的藻泥樣品與提取劑體積有最佳比例。王玉芳等[13]、楊彩根等[14]、徐彩萍等[15]研究結(jié)果也表明乙醇提取葉綠素效果比丙酮好，但翁笑艷等[16]分析指出用丙酮提取地表水浮游植物中的葉綠素a，提取量更高。不同提取劑對(duì)不同植物中葉綠素的提取量不同，其原因應(yīng)歸結(jié)于不同物種的細(xì)胞組成和結(jié)構(gòu)上的差別。該試驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇比丙酮更有利于提取亞心形扁藻中的葉綠素，因此，進(jìn)一步研究乙醇提取葉綠素的優(yōu)化條件以最大限度地獲取亞心形扁藻中的葉綠素。

2.2 亞心形扁藻中葉綠素的優(yōu)化提取條件

從表1可看出，不同試驗(yàn)條件下提取的葉綠素含量從大到小依次為葉綠素a、葉綠素b、葉綠素c。由極差R大小可見，影響葉綠素a提取量的因素主次順序依次為A、B、C，即乙醇濃度影響最大，提取時(shí)間次之，提取溫度影響最小；影響葉綠素b提取量的因素主次順序依次為B、C、A，即提取時(shí)間影響最大，提取溫度次之，乙醇濃度影響最小；影響葉綠素c提取量的因素主次順序?yàn)橐来蜟、B、A，即提取溫度影響最大，提取時(shí)間次之，乙醇濃度影響最小。

乙醇濃度對(duì)葉綠素a、b和c提取量的影響趨勢(shì)相似，且影響不大。3種葉綠素的提取量均在乙醇濃度為85%時(shí)達(dá)最大，說明85%乙醇濃度是最佳的提取劑濃度。提取時(shí)間對(duì)葉綠素b提取量的影響較大，對(duì)葉綠素a和c提取量的影響較小，這應(yīng)與3種葉綠素的結(jié)構(gòu)差異性有關(guān)；隨著時(shí)間的延長，提取量均下降，是因?yàn)槿~綠素不穩(wěn)定。因此，提取葉綠素的時(shí)間應(yīng)盡可能短，確定9 min為最佳提取時(shí)間。

提取溫度對(duì)3種葉綠素提取量的影響趨勢(shì)與提取時(shí)間對(duì)其的影響相似。說明提取亞心形扁藻中葉綠素有合適的提取溫度。當(dāng)溫度升高時(shí)，葉綠素分解導(dǎo)致提取率下降，因此，確定優(yōu)化的提取溫度為35 ℃。

3 結(jié)論與討論

葉綠素主要包括a、b、c、d 4種，為適應(yīng)不同光照條件下的生長，不同葉綠素吸收光的波長范圍不同。其中葉綠素a分子是光合作用的中心色素分子，任何進(jìn)行放氧光合作用的植物細(xì)胞內(nèi)都含有葉綠素a；葉綠素b、c、d具有吸收光子的作用，葉綠素b主要存在于高等植物、綠藻中，葉綠素c主要存在于硅藻、褐藻、鞭毛藻中，葉綠素d主要存在于紅藻中[17]。

亞心形扁藻屬于綠藻門（Chorophyta）綠藻綱（Chlorphyceae）團(tuán)藻目（Volocales）衣藻科（Chlamydomonaceae）扁藻屬（Platymonas），是具有4根鞭毛的海洋單細(xì)胞綠藻[3]，因此，細(xì)胞內(nèi)的葉綠素a和葉綠素b的含量高。亞心形扁藻中存在少量的葉綠素c，增加了其對(duì)某些波長光的吸收，有助于自身的生長。

楊洪芳等[18]用乙醇-超聲法萃取小球藻葉綠素a，確定的優(yōu)化條件是乙醇濃度95%、提取溫度53 ℃、提取時(shí)間10 min。楊代宇等[9]用乙醇提取鹽藻中葉綠素的優(yōu)化條件為乙醇濃度85%、提取時(shí)間12 min、提取溫度40 ℃。該試驗(yàn)確定的乙醇提取亞心形扁藻中葉綠素的優(yōu)化條件是乙醇濃度85%、提取時(shí)間9 min、提取溫度35 ℃，在此條件下，葉綠素a、b、c的總提取量為9.07 mg/g。與楊洪芳等[18]、楊代宇等[9]的結(jié)果有所不同，說明微藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和組成影響葉綠素最佳提取條件的確定。

該試驗(yàn)比較了丙酮和乙醇提取亞心形扁藻中葉綠素含量，發(fā)現(xiàn)乙醇提取效果明顯優(yōu)于丙酮，與楊代宇等[9]的研究結(jié)果一致。用丙酮提取葉綠素時(shí)提取時(shí)間長，易導(dǎo)致葉綠素的分解，影響其純度和質(zhì)量；同時(shí)丙酮易揮發(fā)，毒性較強(qiáng)，長時(shí)間接觸，不利于人體健康。用乙醇提取鹽藻和亞心形扁藻中的葉綠素時(shí)，時(shí)間短，避免了葉綠素的分解；提取溫度略高于室溫，提取量高；用乙醇作提取劑，避免了長期接觸丙酮對(duì)人體的毒害。該試驗(yàn)結(jié)果將為從海洋微藻中提取用于食品、醫(yī)藥和日化工業(yè)的葉綠素提供參考。

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