委內瑞拉鏈霉菌Snea253殺線蟲活性化合物的分離純化與結構鑒定

譚卓 　朱峰 　朱曉峰 　楊傳旭 　王媛媛 　段玉璽 　劉曉宇　+陳立杰

摘要：為研究委內瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae）Snea253發酵液中具有殺線蟲活性的脂溶性化學成分，利用薄層層析、柱層析、高效液相色譜等技術對其活性成分進行分離與純化，以南方根結線蟲二齡幼蟲為靶標進行活性跟蹤，通過HRMS、1H-NMR、13C-NMR等現代波譜技術，鑒定其結構為鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，簡稱DBP）。進一步檢測DBP對9種植物病原真菌和3種細菌的抑菌活性發現，該化合物對粉紅聚端孢菌（Trichothecium roseum）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）也具有抑制作用。

關鍵詞：委內瑞拉鏈霉菌Snea253；鄰苯二甲酸二丁酯；結構解析；南方根結線蟲；粉紅聚端孢菌；巨大芽孢桿菌

中圖分類號： S432.4+5文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0081-04[HS）][HT9.SS]

根結線蟲（Meloidogyne spp.）是我國乃至世界農業生產上影響最大的一類線蟲病害，嚴重影響蔬菜、水果和其他各種農林作物的生產[1]。目前針對線蟲病害的高效化學農藥如涕滅威、溴甲烷等因環境安全問題陸續被禁用或被限制使用，因此尋找替代高效低毒、低殘留的有效殺線蟲劑成為當今世界的研究熱點。放線菌中以鏈霉菌屬產生的生物活性物質最多，如阿維菌素是灰色鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）發酵產生的大環內酯類抗生素[2]，已被證明具有高效廣譜殺線蟲活性。尼可霉素是從唐德鏈霉菌（St.tendae）的發酵液中分離的一種核苷肽基抗生素[3]，含有20多個組分，很多組分有活性，可以有效防治線蟲，且對動物、蜜蜂和植物安全。梅嶺霉素是由南昌鏈霉菌（St.nanchangensis）產生的十六元大環內酯類抗生素，與阿維菌素母核一致[4]，具有廣譜殺蟲活性，尤其對小桿線蟲具有非常好的活性，只需要5 mg/L即可達100%的致死率[5]。

委內瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae）Snea253菌株（ZL200810010465.X）是本研究團隊前期研究發現的高效殺線蟲菌株，其代謝物對大豆胞囊線蟲（Heterodera glycines）、南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）、北方根結線蟲（M. hapla）的二齡幼蟲均具有較高的生物活性[6-7]。李玲玉等通過萃取操作將Snea253的發酵液分為水溶性和脂溶性2部分，并從水溶性部分中分離純化得到具有殺線蟲活性的氨基糖類化合物[8]。本研究采用薄層層析、柱層析、高效液相色譜等技術從Snea253發酵液中分離純化具有殺線蟲活性的脂溶性化合物，通過HRMS、1H NMR、13C NMR等現代波譜技術進行結構解析，并進一步檢測該化合物對農業常見致病菌的抑制活性，為該菌株的產業化生產奠定理論研究基礎。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1供試菌株

委內瑞拉鏈霉菌（S.venezuelae）Snea253菌株，已經獲得國家發明專利授權（ZL200810010465.X）[6]。由沈陽農業大學北方線蟲研究所提供。

1.1.2供試病原菌

真菌：粉紅聚端孢菌（Trichothecium roseum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、茄腐鐮孢（Fusarium solani）、白頭翁葉斑病菌（Ascochyta anemones）、人參黑斑病菌（Alternaria panax）、番茄早疫病菌（Alternaia solani）、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、向日葵菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）， 均由沈陽農業大學[LM]植物保護學院真菌課題組提供。

細菌：惡臭假單孢桿菌（Pseudomonas putida）、叢毛單胞菌（Comamonas terrigena）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），均由沈陽農業大學北方線蟲研究所提供。

1.1.3培養基

高氏一號培養基（可溶性淀粉20 g、NaCl 0.5 g、KNO3 1.0 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂15.0 g、純凈水1 000 mL，pH值7.1～7.3）；PDA培養基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂15.0 g、純凈水1 000 mL） ；NA培養基（牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、酵母浸膏1 g、瓊脂20 g、蔗糖10 g、蒸餾水1 000 mL，pH值=7.0）

1.1.4主要儀器與試劑

發酵罐GUGS-50（鎮江東方生物工程設備技術有限公司）；分析型高效液相色譜系統：Waters 600 Controller高效液相色譜儀，以溶劑峰為內標；Waters 2487紫外檢測器；Bruker Avance 600 MHz核磁共振儀（德國Bruker公司）；四級桿飛行時間質譜儀（德國Bruker公司）。

柱層析硅膠（200～300目，青島海洋化工有限公司）、甲醇為色譜級（沈陽市新光化工廠）、石油醚和乙酸乙酯等化學試劑均為國產分析純。

1.2試驗方法

1.2.1Snea253發酵液的制備

種子液制備：將Snea253菌株接種于高氏一號培養基上，置于28 ℃恒溫箱培養5 d，而后接種于高氏一號液體培養基中，于180 r/min、28 ℃振蕩培養 48 h，制備種子液。

發酵液的制備：20 mL種子液接種于裝液量35 L高氏一號液體培養基的發酵罐中，于28 ℃、220 r/min條件下培養 7 d。

1.2.2殺線蟲活性物質的分離

發酵液預處理：35 L Snea253發酵液，經10 000 r/min離心，去除菌絲體，上清液在40 ℃條件下旋轉蒸發濃縮至原體積的1/5，向其中加入5倍體積的無水乙醇，充分攪拌后置于-4 ℃冰箱內靜止48 h，濾除沉淀取上清液，旋轉蒸發濃縮。所得濃縮液經乙酸乙酯萃取3次，合并有機層，加入無水硫酸鈉，干燥過夜，抽濾除去無水硫酸鈉，并用乙酸乙酯充分洗滌，將濾液旋轉蒸發去除溶劑獲得脂溶性粗提物。

活性組分分離：將粗提物用少量乙酸乙酯溶解經硅膠柱層析分離（石油醚-乙酸乙酯系統），薄層色譜（thin layer chromatography，簡稱TLC）檢測并合并，所得流分經減壓濃縮后測定活性。經柱層析獲得具有殺線蟲活性的流分，經TLC檢測，斑點少且各斑點遷移率相差較大，故采用制備型薄層層析進一步分離純化，展開劑為石油醚 ∶[KG-*3]乙酸乙酯=10 ∶[KG-*3]1。將分離所得組分置于-20 ℃保存備用，進行活性檢測。

1.2.3化合物的結構鑒定

采用高分辨質譜（high-resolution mass spectrometer，簡稱HRMS）和核磁共振波譜技術，對Snea 253殺線蟲活性組分進行結構解析。

HRMS工作條件：掃描模式是正離子模式，m/z掃描范圍為50～3 000，毛細管電壓為4 500 V，霧化器壓力為 30 000 Pa，干燥器溫度為180 ℃，流速為4.0 L/min。

核磁共振工作條件：樣品用三氯甲烷溶解，在Bruker Avance 600 MHz儀器上進行掃描，測定氫譜和碳譜，測試溫度為25 ℃，以溶劑峰為內標，1H-NMR譜測試譜寬為 12 335.526 Hz，13C-NMR譜測試譜寬為39 062.500 Hz。

1.2.4活性組分對南方根結線蟲二齡幼蟲的活性檢測

準確稱取50 mg活性組分（Snea253-Ⅰ-1），加入0.8 mL甲醇，充分溶解后加入0.2 mL吐溫80獲得濃度為50 mg/mL母液，用無菌水將母液分別稀釋為濃度1～5 mg/mL等5個梯度的藥液，測定其對南方根結線蟲二齡幼蟲的致死率和致死中量LC50。取潔凈滅菌的貝氏小皿，加入20條南方根結線蟲二齡幼蟲，再向其中滴加300 μL不同濃度的藥液混勻。以 1 mL 甲醇與吐溫80（4 ∶[KG-*3]1）作為空白母液，依據對應的測試液用無菌水稀釋作為對照（CK），每個處理重復3次。24 h鏡檢并統計結果，計算線蟲死亡率及校正死亡率。

[JZ]線蟲死亡率=[SX（]線蟲死亡數供試線蟲數[SX）]×100%。

校正死亡率=[SX（]處理線蟲死亡率-對照線蟲死亡率1-對照線蟲死亡率[SX）]×100%。

1.2.5Snea253活性組分的抑菌活性測定

抑制病原真菌的活性測定：采用菌絲生長速率法和牛津杯法。準確稱取 50 mg 活性組分，用0.8 mL甲醇充分溶解，再加入0.2 mL吐溫80配成母液，用無菌水稀釋成不同濃度的藥液，以甲醇加吐溫80的溶劑和蒸餾水為2個空白對照，分別加100 μL于牛津杯內，重復3次，28 ℃恒溫箱中培養72～96 h，觀測計量抑菌活性。

抑制細菌的活性測定采用劃線法和牛津杯法，操作方法同上。

2結果與分析

2.1Snea253發酵液活性物質的分離純化

25 L Snea253發酵液經離心、濃縮、醇沉、濃縮和萃取操作共獲得1.5 g褐色漿狀物，為脂溶性粗提物。粗提物經硅膠柱層析獲得3個流分：Snea253-Ⅰ（300 mg）、Snea253-Ⅱ（450 mg）、Snea253-Ⅲ（400 mg），其中僅Snea253-Ⅰ具有殺線蟲活性。利用薄層層析技術分析Snea253-Ⅰ，發現有2個高含量組分，遷移率分別為0.24、0.49，間距相差較大，適宜用制備薄層層析繼續分離純化。活性組分Sne253-Ⅰ通過制備薄層層析進一步分離，得到2個組分Snea253-Ⅰ-1（150 mg）、Snea253-Ⅰ-2（45 mg）。結果表明，Snea253-Ⅰ-1有明顯的殺線蟲活性。高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）檢測Snea253-Ⅰ-1純度可達95%以上（圖1），可以用于高分辨質譜和核磁共振儀器的測定。

2.2Snea253殺線蟲活性組分Snea253-Ⅰ-1的結構解析

2.2.1Snea253-Ⅰ-1的高分辨質譜檢測

正離子模式下，Snea253-Ⅰ-1的高分辨質譜中[M+Na]+離子峰的質核比為301.141 1（理論值：301.141 6）。由此可初步確定，活性物質Snea253-Ⅰ-1的分子式為C16H22O4，相對分子量為278 u（圖2）。

依據上述HRMS、1H-NMR、13C-NMR譜圖解析結果，經分析確定Snea253-Ⅰ-1化合物的結構為鄰苯二甲酸二丁酯（DBP），結構式如圖5所示。

2.3Snea253-Ⅰ-1活性檢測結果

2.3.1Snea253-Ⅰ-1殺線蟲活性的檢測結果

以南方根結線蟲二齡幼蟲為靶標進行活性檢測，結果（圖6）表明，Snea253-Ⅰ-1（DBP）在各個濃度梯度下殺線蟲活性均高于粗提物和Snea253-Ⅰ。

2.3.2Snea253-Ⅰ-1的抑菌活性

活性組分的抑菌試驗結果表明，在供試的9種病原真菌中，Snea253-Ⅰ-1只對粉紅聚端孢菌（Trichothecium roseum）具有明顯的抑制作用，而對玉米大斑病菌等其他8種病菌均不具有明顯的抑制作用。在供試的3種細菌中，僅對巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）具有一定的抑制作用，而對其他2種細菌無效果。

3討論

生物農藥的開發和應用是未來農業病害防治的趨勢。利用生物活體或其代謝物殺滅或抑制農業有害生物，可以保護生態環境，減少人畜傷害，促進農業可持續發展[9-10]。近幾年，研究人員在微生物農藥的研究與開發過程中，通過高通量篩選獲得了大量具有各種生物活性的微生物，它們的代謝物所表現的高活性通常是多種化合物的協同作用[11]，因此分離純化代謝物中的重要活性成分并明確化學結構是生物農藥開發和利用過程中的重點研究方向。它不僅可以指導代謝調控的方向，更重要的是可以從中發現新型農藥合成的先導化合物，為綠色農藥的開發提供結構基礎。

委內瑞拉鏈霉菌Snea253是一株高效殺線蟲菌株，我們期望通過基因組調控使其產生大量高活性物質，提高活性和穩定性，進而將其開發為可商品化的生物農藥。因此在前期的研究中，李玲玉等從Snea253發酵液的水溶性組分中分離純化得到具有殺線蟲活性的氨基糖類化合物，明確了水溶性組分中的有效成分[8]。而本研究側重于對脂溶性組分中有效成分的探索，首次從Snea253發酵液的脂溶性組分中分離并得到兼具殺線蟲活性和抑菌活性的化合物，該化合物的結構通過高分辨質譜儀（high resolution mass spectrum，簡稱HRMS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，簡稱NMR）[12]進行鑒定，確定其結構為鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）。

目前，國內外已經報道了有關微生物產鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）的研究，Roy等研究表明，鏈霉菌（Streptomyces albidoflavus）321.2產生的DBP對G+細菌、G-細菌及Saccharomyces cerevisiae、Aspergillus niger、Curvularia pallescens等真菌均具有較強的抑制作用[13]。馬桂珍等從海洋放線菌BM-2菌株分離的DBP對禾谷鐮刀菌具有較強的抑制作用[14]。劉偉等從海洋小鏈霉菌DY2741的代謝產物中分離獲得的DBP對金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）具有抑制作用[15]。研究結果表明，DBP本身有較好的抑菌活性。

本研究從Snea253中分離獲得的DBP不僅具有一定的抑菌活性同時還具有一定的殺線蟲活性，最重要的是其化學結構具有衍生化和改變結構的發展潛力，為活性基團的修飾提供很好的結構基礎，可作為先導化合物進行殺線蟲農藥的合成。本研究結果為Snea253發酵液作為殺線蟲生物農藥的研發奠定了化學結構的基礎，相關的研究工作仍在進行中。

參考文獻：

[1]段玉璽. 植物線蟲學[M]. 北京：科學出版社，2011：1-3.

[2]Mrozik H，Eskola P，Linn B O，et al. Discovery of novel avermectins with unprecedented insecticidal activity[J]. Cellular and Molecular Life Sciences，1989，45（3）：315-316.

[3]陳蔚，譚華榮. 尼可霉素（Nikkomycins）多組分結構及其生物合成相關基因的研究進展[J]. 生物工程學報，2000，16（5）：548-550.

[4]孫宇輝，周秀芬，涂國全，等. 南昌鏈霉菌代謝產物與代謝工程研究現狀的回顧與展望[J]. 生命科學，2005，17（3）：207-210.

[5]左一鳴，王開運，姜興印. 4種抗生素類殺蟲劑對小菜蛾不同齡期幼蟲的毒力和殺卵作用[J]. 農藥，2004，43（1）：25-27.

[6]陳立杰，陳井生，段玉璽. 具毒殺植物線蟲活力的鏈霉菌的制備方法及其應用：CN101225370[P]. 2008-07-23.

[7]陳井生，陳立杰，段玉璽，等. 放線菌Snea253代謝產物殺線蟲譜研究[J]. 上海農業學報，2010，26（3）：80-82.

[8]李玲玉，趙迪，劉曉宇，等. 放線菌Snea253代謝產物及寡糖對南方根結線蟲活性的影響[J]. 天然產物研究與開發，2014，26（1）：117-122.

[9]何樹文，達世彩. 生物農藥的國內外發展動態[J]. 湖北植保，2013（5）：60-62.[ZK）]

[10]張愛華，任志成，王壯，等. 不同生物源農藥對西洋參主要病害的室內抑菌活性及田間防效[J]. 江蘇農業科學，2015，43（11）：197-200.

[11]劉長令，李正名. 以天然產物為先導化合物開發的農藥品種（Ⅰ）——殺菌劑[J]. 農藥，2003，42（11）：1-4.

[12]田靖，王玲. 核磁共振技術在農業中的應用研究進展[J]. 江蘇農業科學，2015，43（1）：12-15.

[13]Roy R N，Laskar S，Sen S K. Dibutyl phthalate the bioactive compound produced by Streptomyces albidoflavus 321.2[J]. Microbiological Research，2006，161（2）：121-126.

[14]馬桂珍，吳少杰，付泓潤，等. 海洋放線菌BM-2菌株抗真菌活性物質的分離純化與結構鑒定[J]. 中國生物防治學報，2014，30（3）：393-401.

[15]劉偉，徐濤，蔡敬民，等. 海洋小鏈霉菌DY2741抗菌物質的溶解性質及分離純化[J]. 食品科學，2010，31（15）：177-180.