對茶樹炭疽病病菌具拮抗作用根際促生細菌的分離、篩選及鑒定

王國君 陳利軍 熊建偉 智亞楠

摘要：為了篩選出對茶樹炭疽病病菌具有拮抗作用的根際促生細菌，從河南省信陽市茶園采集85份土樣，分離得到23株具有拮抗作用的細菌，利用平板對峙法篩選出對膠孢炭疽菌具有較強拮抗作用的7株細菌菌株，且其代謝產物對茶樹炭疽病病菌的平均抑制率達到53.20%。依據生理生化特征經初步鑒定，7株拮抗菌株均隸屬于芽孢桿菌屬。試驗結果為進一步構建多功能植物根際促生菌廣適菌群提供菌株資源。

關鍵詞：茶樹；炭疽病病菌；拮抗作用；根際促生細菌；篩選

中圖分類號： S435.711文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0076-03[HS）][HT9.SS]

茶樹炭疽病是一種由真菌侵染引起的病害，是常見的茶樹葉部病害之一，在我國各產茶區均有發生，山區茶園尤為普遍[1]，該病發病嚴重時可導致茶樹大量落葉，并造成茶樹樹勢衰落和茶葉產量與品質降低，還影響翌年春季茶葉的產量。

目前，茶園主要利用化學藥劑防治茶樹炭疽病，但長期使用化學藥劑會導致病原菌抗藥性增強，并可造成農藥殘留、環境污染等一系列問題。在化肥農藥零增長的大背景下，如何開發生物制劑來防治茶樹炭疽病尤為重要。植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，簡稱PGPR）指生存于植物根際、根表，并能直接或間接地促進或調節植物生長的微生物[2]，它能夠通過多種機制促進植物的生長，目前人們普遍認同的生物學功能主要有拮抗病原菌、誘導系統抗性、改善根際微生態環境等[3]。國外研究人員已從水稻、小麥、玉米、甘蔗和棉花等作物根際分離篩選出許多高效、優良的促生菌株，并且部分菌株已實現商業化[4-6]。陳波等分離篩選出對櫻桃生長有明顯促進作用的假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）[7]；史國英等分離得到1株對甘蔗具有促生作用的細菌，經鑒定為克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.）細菌[8]；周晨昊等研究發現，將篩選到的1株植物根際促生細菌JD37與蚯蚓糞混合對小白菜與蕹菜具有顯著的促生作用，其鮮質量和產量均有明顯提高，還具有降低2種蔬菜中亞硝酸鹽含量的作用[9]。

本研究從茶樹根際土壤中分離PGPR，初步研究其對茶樹炭疽病病菌的拮抗作用，通過形態學和生理生化特性對其鑒定，為構建高效廣適促生菌群提供菌株材料。

1材料與方法

1.1供試樣品

從河南省信陽市浉河港鎮、董家河、震雷山、信陽農林學院等地的茶園中，共采集85份根際土壤樣品，放入自封袋，分別標記為SHG、DJH、ZLS、XYNL，并加以編號，置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.2供試培養基[10]

PDA培養基：200 g去皮馬鈴薯、20 g葡萄糖、18 g瓊脂；NA培養基：5 g牛肉浸膏、10 g蛋白胨、5 g NaCl、18 g瓊脂、pH值為7.2；NB培養液：3 g牛肉浸出膏、5 g蛋白胨、5 g NaCl、1 000 mL水、pH值為7.0～7.2。

1.3供試病原真菌

盤長孢菌（Gloeosporium theae-sinesis Miyake）由信陽農林學院農藥學實驗室分離和保存。

1.4細菌的分離和純化

稱取10 g土樣，加入裝有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，于120 r/min搖床上振蕩30 min，即為10-1稀釋液，取 1 mL 10-1 稀釋液加入盛有9 mL無菌水的試管中，即為10-2稀釋液，依此類推，用無菌水稀釋成10-3～10-7稀釋液，分別取5 μL涂布于3種固態培養基平板上，每個濃度重復3次，置于26～27 ℃恒溫箱中培養3～5 d后，挑取單菌落作為參試菌株。

1.5對茶樹炭疽病病原菌拮抗作用的測定

1.5.1[JP2]細菌菌株對茶樹炭疽病病原菌拮抗性測定

采用對峙生長法測定茶樹根際細菌對膠孢炭疽菌的拮抗性。即在直徑為9 cm的PDA平板正中央接入直徑為5 mm的膠孢炭疽菌菌塊，同時在距平板中心2.5 cm處的4個點上分別接入1環目標細菌菌落，對照不接篩選菌株，只接入培養基，于 27 ℃ 恒溫箱內培養72 h，測量從茶樹根際土壤中篩選的細菌的菌落邊緣和茶樹炭疽病病原菌菌落邊緣之間的抑菌帶寬度，篩選出對茶樹炭疽病病原菌具有拮抗作用的菌株。同時觀察篩選菌的菌落大小和生長速度，選出拮抗作用明顯的細菌。[JP]

1.5.2拮抗細菌代謝產物對供試病原菌的抑制作用

將初篩的拮抗細菌于NB培養液中28 ℃振蕩培養3 d，將發酵液以8 000 r/min離心15 min，取上清液，最后用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾，每個處理重復3次。將2 mL無菌濾液和20 mL NA培養基混合均勻倒入培養皿，冷卻凝固后，在每個培養皿中央接入直徑為5 mm的供試病原菌菌塊，27 ℃下培養24 h。以直接培養的炭疽菌作為對照，用垂直十字法分別測量含測試菌發酵液條件下和不含發酵液條件下的病原菌菌塊直徑，用如下公式計算抑制率：

[JZ]抑制率=[SX（]對照菌落直徑-處理菌落直徑對照菌落直徑[SX）]×100%。

1.6拮抗菌株的初步鑒定

對拮抗菌株進行革蘭氏染色、芽孢染色、硝酸鹽還原反應、伏-普（V-P）反應、檸檬酸鹽利用反應、淀粉水解、厭氧性試驗、接觸酶反應，以及葡萄糖、蔗糖、甘露醇產酸等形態學及生理生化分析，對拮抗菌株進行初步鑒定。

2結果與分析

2.1不同樣品中分離的細菌菌株及拮抗菌株

從85份根際土壤樣品中分離細菌，對分離出的根際細菌根據其菌落形態、顏色等挑取單菌落，按常規方法純化后保存，共獲得254株細菌菌株，根據菌落的形態特征，經過進一步篩選，發現具有拮抗作用的菌株23株，其中7株菌株對茶樹炭疽病病原菌具有較強的拮抗作用。如表1所示，7株目標拮抗菌株主要來自震雷山茶場、浉河港鎮何家寨茶場、董家河尖山茶場。菌株來源相對分散，相比較而言，化學防治較少的震雷山茶場分離得到的菌株較多，從側面反映化學殺菌劑的使用可能導致茶樹根際微生物種群中有益微生物的數量減少。另外，7株菌株均出自相對肥沃的土壤，這與孫海新等的研究結論[11]一致。從茶樹品種來看，4株菌株來源于福鼎大白茶、2株來源于龍井43、1株來源于白毫早，而福鼎大白茶在茶區種植面積較大，因此，不同茶樹品種對拮抗菌株是否存在一定的影響需要進一步研究證明。

2.4拮抗細菌的鑒定

由表4可知，7株拮抗細菌革蘭氏染色反應、芽孢染色反應、硝酸鹽還原反應、V-P測定、檸檬酸鹽利用反應、運動性、淀粉水解反應、接觸酶反應、葡萄糖產酸、蔗糖產酸、甘露醇產酸反應等均呈陽性，厭氧性試驗均呈陰性。根據細菌形態特征觀察和生理生化反應結果，參照《常見細菌系統鑒定手冊》[12]和《芽孢桿菌屬》[13]，初步確定這7株菌株均屬于芽孢桿菌屬。

3結論與討論

目前，植物根際促生細菌的篩選利用及其促生機制的研究已成為一個熱點[14-15]。從本試驗篩選的初步結果看，7株菌株代謝產物平均拮抗抑制率為53.20%，經生理生化鑒定，7株菌株均為芽孢桿菌屬。雖然拮抗抑制率與申光輝等所篩選的拮抗菌株的拮抗抑制率[16]有差距，但是并不能簡單認為其生防效果不理想。因為拮抗作用只是促生細菌作用中的一個方面，需要從多個方面綜合篩選方可成功開發出生產中具有意義的微生物農藥。另外，拮抗菌株在室內和田間表現的穩定性往往存在差異，有研究表明物理、化學、微生物種群等環境條件會對細菌生長造成影響，從而制約其促生效果[17]。因此，在室內試驗中拮抗效果不突出的菌株，并不意味著不具有開發價值。要將所篩菌株在農業生產上用于防治植物病害，尤其是防治茶樹炭疽病還需進一步通過田間試驗來驗證，如果田間防治效果較好，那么對于其產生的抗菌活性物質有效成分的分離、純化、結構鑒定等都值得進一步研究。另外，促生機制具有多樣性，能否將7株菌株構建適應不同環境要求的多功能菌群以共同發揮作用也需要進一步研究。

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