水稻Ds標記的曲穗突變體的分子鑒定

焦翠翠+郭妍妍+吳均章+孫丙耀

摘要：在經過Ac/Ds基因標簽系統獲得的水稻Ds插入突變株系中得到1株水稻曲穗突變體植株，對該突變體進行初步表型觀察，結果顯示，成熟期突變體植株的稻穗有一定的彎曲；同時采用TAIL-PCR方法獲得曲穗突變體Ds側翼基因序列，結果證明含有1個Ds插入位點；對Ds側翼序列進行分析發現，Ds插入在2個基因之間，其下游是編碼類泛素特異性蛋白酶1（Ulp1）的基因，該基因與穗的形成有一定的關聯；利用RACE技術擴增Ds插入位點下游基因的cDNA的3′端序列，序列比對發現，Ds插入前后其下游基因序列無變化。預測Ds的插入影響了Ulp1基因的啟動子區域，進而影響水稻的花序生長發育形成穗彎曲水稻突變體。本研究結果可能在穗型的遺傳及發育以及改良優質高產水稻方面有一定的作用。

關鍵詞：水稻；穗型；遺傳；發育；改良；Ulp1；Ac/Ds；3′-RACE技術

中圖分類號： S511.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）11-0026-03

在20世紀五六十年代，我國利用半矮化育種及水稻雜種優勢技術，水稻產量有很大的提高，但近年來，水稻產量一直處于停滯不前的狀態[2]。株型育種是水稻超高產遺傳育種的重要方向，而穗型與水稻株型密切相關，是影響水稻產量的重要因素之一。因而，通過對穗型的研究進而提高水稻產量是很多育種專家所重視的問題。在水稻發育生物學研究及實際農業生產中，與彎曲穗型水稻比較而言，直立穗型能夠改善灌漿結實期群體結構，增強抗倒伏性，提高群體生長率等生理生態特性，但大多數的研究只是簡單地運用統計學對其性狀進行簡單考察，對直立穗型和彎曲穗型分子機制方面的研究較少[3-5]。闡明相關穗彎曲與穗直立基因的遺傳機理，為水稻育種研究提供參考依據，這也是研究優質高產水稻的未來研究方向。本研究對水稻Ds插入突變株系中出現的曲穗突變體進行表型觀察，并擴增Ds側翼序列進行基因的初步鑒定，在此基礎上采用RACE擴增技術擴增Ds標記基因的cDNA序列，分析Ds的插入對水稻穗型變化影響的分子機理。

1材料與方法

1.1材料

曲穗突變體水稻來源于水稻品種Dongjin （Oryza sativa L. var. japonica cv. Dongjin）的Ac/Ds插入突變體系，由韓國國立慶尚大學Han Chang-deok教授實驗室提供，委托江蘇太湖地區農業科學研究所對種子進行播種并栽培。在生長期期間多次觀察其表型，并取田間栽培的野生型與突變體水稻完整植株，帶回實驗室取其幼嫩的新鮮組織，提取植物基因組DNA和RNA用于后續試驗研究。抽穗期間，突變體較野生型水稻抽穗較早并在該期間株高有顯著差異；成熟期，突變體與野生型植株穗彎曲程度存在明顯差異（圖1）。

1.2方法

1.2.1引物設計根據轉座子Ds的序列特點，在Ds的3′末端設計引物SP1、SP2、SP3，分別與隨機簡并引物AD1、AD2搭配，進行TAIL-PCR的3輪擴增；以TAIL-PCR擴增獲得的Ds側翼水稻序列設計3′-RACE擴增特異引物。除了RACE的通用引物外，其他引物均采用Primer Premier 6.0和Oligo 7軟件進行設計，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，序列見表1。

1.2.2突變體水稻Ds側翼序列的擴增采用TaKaRa植物DNA提取試劑盒，對野生型和突變體水稻的單株葉片DNA進行分離提取；采用核酸微量紫外分光光度計（Thermo Scientific NanoDrop 2000）對所提取的DNA進行濃度和純度檢測，選取純度較高的DNA作為后續PCR反應模板；

突變體基因組DNA進行Ac/Ds元件插入檢測，確認含有Ds插入后進行Ds側翼序列擴增；以曲穗突變體基因組作為模板，以隨機簡并引物AD1和AD2分別與特異引物SP1、SP2、SP3搭配進行TAIL-PCR的3輪反應擴增Ds的側翼序列；根據引物設計特點，TAIL-PCR的2、3輪反應產物大小應相差36 bp，然后對第3輪反應特異條帶進行割膠，采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0回收、純化特異擴增產物；將其產物連接到PMD19-T Vector進行TA克隆，16 ℃條件下連接過夜；連接產物轉化至大腸桿菌JM109感受態細胞進行藍白斑篩選，挑取10個單菌落，在LB液體培養基中培養過夜；將菌液PCR驗證為陽性克隆的菌液，送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行序列測定，獲得Ds側翼序列。

1.2.3Ds標記基因cDNA的RACE擴增對野生型和曲穗突變體的不同組織，利用Trizol法提取總RNA。采用TaKaRa公司Reverse Transcriptase M-MLV試劑盒，建立反轉錄反應體系，將提取的總RNA反轉錄為cDNA，將其作為RACE擴增反應的模板。

第1輪RACE反應體系（50 μL）包括5 μL的10×Buffer、3 μL的dNTPs （2.5 mmol/L）、1.5 μL引物US、0.3 μL的引物UL、1.5 μL的1輪特異引物、0.25 μL rTaq DNA 聚合酶（5 U/μL）以及約200 ng cDNA模板。反應循環參數為：94 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25個循環。第2輪反應中，以通用引物NUP與第2輪的特異引物搭配，為了得到理想的結果，再以第2輪擴增產物為模板重復第2輪反應。退火溫度依據特異引物與NUP的解鏈溫度（Tm）值確定。依據預測的RACE目標條帶大小以及2、3輪結果比對，選取第3輪反應中合適的電泳遷移條帶，經膠回收、TA克隆后，將菌液送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行序列測定。

1.2.4突變體中Ds的染色體定位、插入位點以及Ds標記基因的生物信息學分析將測序獲得的Ds側翼序列與NCBI數據庫中序列進行在線比對（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），確定突變體基因組上Ds的染色體定位和基因位點。將測序獲得的cDNA的序列與NCBI數據庫中序列進行在線比對，分析Ds插入前、后標記基因的結構。

2結果與分析

2.1曲穗突變體基因組上Ds的插入位點

對曲穗突變體進行基于TAIL-PCR技術的Ds側翼序列的擴增，結果見圖2。以突變體基因組DNA為模板進行擴增獲取得到Ds側翼序列，通過NCBI-BLAST在線比對和分析發現，Ds插入在3號染色體上（Sequence ID：dbj|AP014959.1|），插入在2個基因之間，下游為類泛素特異性蛋白酶1（Ulp1）基因（圖3），該基因與穗的形成有一定的關聯，由此推測Ds的插入會對下游基因Ulp1的表達有影響。

2.2Ds標記基因cDNA末端序列的分析

TAIL-PCR擴增的Ds側翼序列分析表明，Ds插入在2個基因之間，但下游基因對穗的形成有關聯，以此為基礎，提取下游基因相關序列設計2對不同的RACE特異引物，并分別以野生型和曲穗突變體水稻總RNA反轉錄產生的cDNA為模板進行RACE擴增反應并對其擴增產物進行電泳分析（圖4），第1對特異性引物組合RACE1-1和RACE1-2中，曲穗突變體第3輪擴增產物有1條約為400 bp的主條帶，第2對特異性引物組合RACE2-1和RACE2-2中，野生型和突變體2、3輪擴增產物都有1條約為800 bp的主條帶，經序列測定800 bp左右的條帶為特異擴增產物。測序結果顯示，Ds插入前后，下游編碼Ulp1的基因序列無變化。預測Ds的插入位置對Ulp1基因的啟動子結構有一定的影響，有研究表明Ulp1調節SUMO/Smt3代謝途徑，而SUMO/Smt3途徑對細胞分化及細胞生長、DNA的復制與修復、核蛋白導入和靶向以及植物開花時期有重要作用[6-7]。

3討論與結論

玉米Ac/Ds雙因子系統屬于DNA轉座元件hAT超家族的成員，近年來運用Ac/Ds雙元件系統構建水稻突變體庫已經有了很大的進展，日本、美國、韓國、荷蘭、澳大利亞等不同的國家都有科學家致力于水稻突變體庫的構建，這為高通量突變體篩選、功能基因組學研究以及突變體庫的構建和育種奠定了基礎。同時，利用水稻基因組中大量的序列信息去闡明基因的生物學功能、鑒定以及克隆相關農藝性狀的基因，對改良水稻的生產性能和品質具有重要意義。

穗型是水稻的重要形態特征之一，與水稻產量水平有著密切的聯系，是水稻理想株型育種和栽培研究關注的焦點[8]。有研究表明，直立穗型和彎曲穗型在直鏈淀粉含量、不同部位粒型分布等方面都有區別[9-10]，在實際生產中由于直立穗型群體的實粒數、千粒質量明顯高于彎曲穗型群體，特別是直立穗群體的二次枝梗實粒率比彎曲型群體高10%以上，以及直立穗更能充分利用光照條件進行光合作用，更傾向于直立穗型的培育[11]。已有的研究大部分從形態及生理方面著手討論彎曲穗型與直立穗型的不同點，但彎曲穗型與直立穗型在分子機制方面的差異有待進一步研究。

關于控制水稻穗型基因的研究顯示，定位在第2條染色體短臂端nDel標記EJ-4和dCAPs標記EJ-5之間的 FUWA 基因，定位在第6號染色體短臂端SSR標記的Rm253和RM19623之間的EP4基因，定位在9號染色體的qPE9-1基因，在粒長、粒寬、穗彎曲、穗直立等穗型方面進行調控[2，5，12-13]。本研究結果顯示，曲穗突變體的Ds插入在2個基因之間，其下游基因為Ulp1的基因，Ds標記基因cDNA末端序列的分析顯示曲穗突變體水稻與野生型水稻序列無變化，但表型觀察結果證明兩者在穗型彎曲度上確實存在差異，Ac/Ds雙元件檢測也確實有Ds元件的插入，TAIL-PCR結果也證明含有1個Ds的拷貝，說明Ds的插入對突變體穗的形成有影響。Ds插入位置下游基因Ulp1在穗型發育過程中有一定的調節作用。穗型的調控涉及許多不同的生化途徑，包括泛素化途徑，近年來關于控制穗部性狀相關基因陸續被克隆出來，如控制穗型粒寬、粒質量編碼E3泛素連接酶的GW2基因可能參與降解促進細胞分裂的蛋白的過程，進而對水稻穎殼、粒質量和產量方面進行控制，如編碼核定位蛋白的GW5基因，通過泛素蛋白酶體途徑調節控制穗型粒寬、粒質量[14-15]。水稻穗部性狀是由多基因控制的復雜的數量性狀，另外已經克隆的水稻穗型基因還包括D2、GS3、GS5、GW8、TAW1等基因[16-20]，隨著測序技術的發展和分子標記的應用以及突變體的挖掘，已克隆出來的控制穗部性狀的基因揭示了粒穗調控的相關機制，也為利用分子育種手段改良品種奠定了一定的基礎。但是，Ulp1參與的泛素化調解途徑以及在穗型調控的確切機制還有待進一步確認。

另外，本研究對獲得的Ulp1基因沒有進行表達譜的分析，在后續研究中運用熒光定量PCR技術得到該基因在水稻不同組織的表達差異，進一步分析Ds插入是否會對Ulp1基因的表達產生影響。

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