龍爪槐SRAP—PCR反應體系的建立與優化

倪雅楠+劉博

摘要：以龍爪槐（Sophora japonica f. pendula Hort.）葉片為材料，采用L16（45）正交設計試驗，對SRAP-PCR反應體系中的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA用量5個因素進行優化，并確立適用于龍爪槐SRAP-PCR反應的最佳體系。結果表明，龍爪槐SRAP-PCR反應的最佳體系為反應總體積12.5 μL，Taq酶0.10 U、Mg2+ 3.0 nmol/L、dNTPs 2.5 nmol/L、正反向引物均為1.2 nmol/L、DNA 100 ng，其余體積用ddH2O補足。各因素水平變化對反應體系的影響影響大小依次為引物、模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶。用35個龍爪槐樣品對優化體系進行驗證，均得到條帶清晰、多態性豐富的圖譜，證實了該體系的穩定性。

關鍵詞：龍爪槐；SRAP-PCR；正交試驗；反應體系優化

中圖分類號： S687.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）11-0019-03

相關序列擴增多態性（sequence related aplified polymorphism，SRAP），是美國加州大學蔬菜作物系Li等在蕓薹屬（Brassica）中開發出的，利用1對獨特的引物設計方式實現對開放閱讀框架ORFs進行擴增的標記[3]，適合于植物的遺傳多樣性研究、比較基因組學、遺傳圖譜的構建等領域研究。筆者首次采用SRAP技術對龍爪槐的遺傳多樣性進行分析，因此，須要確定其SRAP-PCR的最佳反應體系。

正交試驗能綜合各因素及其相互作用，快速找到影響因素的最佳水平組合，不僅效率高，且結果穩定可靠。正交試驗已被廣泛應用到菊花、荷花和番茄的優化體系中，并已確定最佳的反應體系[4-6]。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為采自北京市35株龍爪槐的嫩葉（表1），硅膠

1.3.4龍爪槐SRAP-PCR最佳反應體系驗證以35份龍爪槐的基因組DNA為模板，隨機選取2個SRAP引物組合ME1-EM7、ME8-EM8，按照上述擴增及檢驗方法，對優化的龍爪槐SRAP-PCR反應體系進行檢測。

1.4數據的統計與分析

采用Excel軟件對試驗結果進行統計和分析。

2結果與分析

2.1龍爪槐SRAP-PCR反應體系的確立

2.1.1試驗材料基因組DNA檢測部分試驗材料的DNA瓊脂糖電泳檢測結果見圖1，DNA條帶清晰、完整，符合SRAP對DNA的要求。

2.1.2正交試驗結果分析根據正交試驗表，每個處理重復3次，得到的電泳結果見圖2，采用不同的反應體系擴增結果存在明顯差異。第1、6、9、10、12、14、15、16組擴增效果較差，條帶不清晰穩定性差；2、11組重復性差，反應體系彌散嚴重，條帶不清晰；4、5、7、8組擴增效果較好，但2、3、5、7、8組條帶豐富性差。綜合以上分析，根據條帶豐富度、清晰度以及重復性等因素初步確定第4組為最佳反應體系。

2.2龍爪槐最佳SRAP-PCR反應體系驗證

應用上述篩選出的龍爪槐最佳反應體系，選取2個引物組合ME1-EM7和ME8-EM8對35個龍爪槐樣品進行PCR擴增。結果（圖3）顯示，隨機選取的這2個引物組合能應用篩選得到的最佳體系擴增出豐富的條帶，且圖譜條帶清晰、穩定性好，證明該最佳體系可以應用到龍爪槐基因組DNA的SRAP-PCR反應中。

3討論

龍爪槐在我國具有悠久的栽培歷史，是園林造景中不可缺少的樹種，目前關于龍爪槐的研究僅局限于嫁接技術、蟲害防治方面[8-13]，對于龍爪槐分子生物學方面的研究還未見報道，因此本研究旨在探究龍爪槐分子水平上的特征，評價龍爪槐的遺傳結構和變異，為龍爪槐種質資源的搜集、保存和利用提供理論依據，并為龍爪槐的分子水平研究奠定一定的基礎。

對PCR反應體系的優化有單因素試驗和正交試驗2種方法，單因素試驗不能兼顧到各因素之間的相互作用，無法分析各組分不同水平對擴增結果影響的差異顯著性，且單因素試驗次數多，耗時耗力成本較高；正交試驗與單因素試驗相比節省試驗時間，用較少的試驗次數便可獲得可靠的試驗結果，并能通過數據反映出各因素間的交互作用。本研究通過正交試驗對影響SRAP-PCR的5個因素和4個水平進行優化和篩選，最終確定龍爪槐SRAP-PCR的最佳反應體系為反應總體積12.5 μL，Taq酶0.10 U、Mg2+ 3.0 nmol/L、dNTPs 2.5 nmol/L、正反向引物均為1.2 nmol/L，DNA 100 ng，其余體積用ddH2O補足。

反應體系中的各個因素之間會產生相互作用，每種因素發生變化都可能影響擴增的結果。本試驗研究結果顯示，各個因素對龍爪槐SRAP-PCR的影響大小依次為引物、模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶。通過查閱相關文獻發現，SRAP-PCR反應體系針對不同物種的分析中，每個反應因素對物種的影響程度均有所不同，因此SRAP-PCR反應體系必須針對不同物種和試劑的差異對主要的影響因素進行優化，保證試驗結果的穩定性和可靠性。

隨著分子生物學的不斷發展，分子標記技術已被廣泛用于植物的遺傳多樣性研究中[14]。陳興彬利用篩選出的多態性高、擴增穩定的7對引物對11個黑松群體進行擴增，共擴增出73個條帶，其中59個多態性條帶，多態性條帶比率為80.82%，平均每對引物擴增出10.4、8.4個多態性條帶[15]；Pinar等用過SRAP標記對地中海地區57株野生杏的遺傳多樣性進行分析，其中19對引物中有16對可以擴增出多態性條帶，擴增出的87段條帶中，有56段具有多態性，多態性條帶比率為64.37%[16]。在本試驗中應用SRAP技術，使用隨機選取的2個引物對，對35份龍爪槐樣品進行分析，獲得32個條帶，多態性條帶有26條，多態性比率為81.25%。以上研究可以看出，SRAP技術擴增條帶豐富度、多態性均較高，且試驗過程中具有較高的穩定性和重復性；SRAP技術可以在未知基因組序列信息的條件下使用，所用引物也具有通用性，因此，SRAP技術適用于龍爪槐遺傳多樣性的研究，同時

也為對龍爪槐進行資源鑒定、基因定位等方面的研究奠定了一定的基礎。

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