竹蓀菌絲中鄰苯二甲酸二丁酯含量的測(cè)定與分析

丁邦菊，湯洪敏，2，*

（1.貴州民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州民族大學(xué)貴州民族醫(yī)藥研究院，貴州貴陽(yáng)550025）

竹蓀菌絲中鄰苯二甲酸二丁酯含量的測(cè)定與分析

丁邦菊1，湯洪敏1，2，*

（1.貴州民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州民族大學(xué)貴州民族醫(yī)藥研究院，貴州貴陽(yáng)550025）

測(cè)定不同生長(zhǎng)時(shí)間竹蓀菌絲中鄰苯二甲酸二丁酯（DBP，Dibutyl Phthalate）的含量，探討竹蓀菌絲對(duì)DBP是否存在富集作用。通過(guò)外標(biāo)法，并做加標(biāo)回收試驗(yàn)，以培養(yǎng)液及空白培養(yǎng)液作為對(duì)照，用乙酸乙酯為溶劑，超聲波輔助提取溶劑法提取竹蓀菌絲干品中的DBP，并應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)其進(jìn)行分析測(cè)定。結(jié)果表明：（1）DBP標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程為y=26 021x-74 798，R2=0.999 9，證明方法在5.0 μg/mL～100.0 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。實(shí)際樣品加標(biāo)回收率為95.4%～105.0%，平均回收率為98.9%，RSD為3.4%。（2）在空白培養(yǎng)液中檢測(cè)出一定含量的DBP，其濃度為19.30 μg/mL。不同培養(yǎng)時(shí)間的培養(yǎng)液中DBP的濃度在17.71μg/mL～20.50 μg/mL范圍，相應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間的竹蓀菌絲中DBP的含量在28.86 mg/kg～33.52 mg/kg范圍。竹蓀菌絲在培養(yǎng)過(guò)程中，能產(chǎn)生和釋放一定量的DBP，并也能一定程度地富集環(huán)境中的DBP。

竹蓀；菌絲；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）

竹蓀（Dictyophora indusiata），是食用真菌[1]。其營(yíng)養(yǎng)豐富，具備藥食同源的價(jià)值。主要分布于云南、四川、貴州、湖南省市。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，竹蓀具有調(diào)脂降壓、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用、抗氧化、增強(qiáng)免疫、保肝[2]等功效。目前，對(duì)竹蓀的研究主要集中在栽培技術(shù)與加工[3-4]，竹蓀營(yíng)養(yǎng)含量分析[5]，活性成分與藥效，提取工藝及其分離純化鑒定等[6-7]方面。其中，對(duì)竹蓀化學(xué)成分的研究中，已有文獻(xiàn)報(bào)道竹蓀中含有鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)[8-10]。鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）是鄰苯二甲酸酯類（PAEs，Phthalate Esters）的一類重要化合物，工業(yè)上被廣泛用于塑料制品的生產(chǎn)，還用作農(nóng)藥、殺蟲(chóng)劑、化妝品、香料等生產(chǎn)材料。DBP在各類環(huán)境中廣泛存在，為優(yōu)先控制污染物。對(duì)人群健康的危害主要表現(xiàn)在三方面，即急性毒性；致畸、致癌、致突變作用；生殖發(fā)育毒性[11]。但有報(bào)道在真菌中存在天然的DBP[12]，對(duì)蚊蟲(chóng)具有一定的驅(qū)避作用[13]，并且生物對(duì)PAEs類具有一定的富集與降解作用[14-15]。

目前，對(duì)DBP的研究主要集中于水、土壤、食品以及對(duì)人體的毒性作用，而對(duì)藥用植物、真菌中的DBP研究較少。關(guān)于對(duì)竹蓀菌絲中DBP的富集作用研究未見(jiàn)報(bào)道，因此，本課題研究旨在通過(guò)有機(jī)溶劑對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)間竹蓀菌絲進(jìn)行提取，采用GC-MS分析測(cè)定，外標(biāo)法定量。并做相應(yīng)空白對(duì)照，確定不同生長(zhǎng)時(shí)間竹蓀菌絲、培養(yǎng)液及空白培養(yǎng)液中DBP的含量。并對(duì)三者中DBP含量進(jìn)行分析比較，判斷竹蓀菌絲對(duì)DBP是否具有富集作用，對(duì)竹蓀產(chǎn)品的質(zhì)量保證和拓展開(kāi)發(fā)潛能具有重要現(xiàn)實(shí)意義，為進(jìn)一步帶動(dòng)竹蓀種質(zhì)的多方向開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

竹蓀菌絲：貴州省榕江縣野生竹蓀轉(zhuǎn)接保存菌絲；培養(yǎng)基：綜合馬鈴薯液體培養(yǎng)基。

鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)準(zhǔn)品：分析純，天津市富精細(xì)化工有限公司；乙酸乙酯（色譜純）、葡萄糖（分析純）：天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司；甲醇、丙酮、硫酸鎂：分析純，重慶川江化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鉀：分析純，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司；維生素B1：生化試劑，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 主要儀器

Agilent7890/5975C-GC/MSD氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

依據(jù)王鑫等[16]對(duì)食品中鄰苯二甲酸酯類污染物的分析研究中的文獻(xiàn)方法，略加改進(jìn)。準(zhǔn)確移取鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)品1.00 mL，用乙酸乙酯逐步稀釋制備成105 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)所需濃度再逐級(jí)用乙酸乙酯進(jìn)行稀釋。以DBP系列標(biāo)準(zhǔn)液濃度（x）為橫坐標(biāo)，平均響應(yīng)值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。

1.3.2 樣品的制備

1.3.2.1 竹蓀菌絲的培養(yǎng)與干品制備

通過(guò)打孔法將菌絲定量接種于250 mL三角瓶50 mL綜合馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，25℃、110 r/min恒溫?fù)u床上分別培養(yǎng)15、30、45 d，同時(shí)并作空白培養(yǎng)液對(duì)照。按培養(yǎng)時(shí)間依次取出，并抽濾菌絲，濾液（即培養(yǎng)液，取100 mL）用無(wú)菌棕色廣口瓶?jī)?chǔ)存，于4℃冰箱中貯存?zhèn)溆?。竹蓀菌絲經(jīng)蒸餾水重復(fù)洗3遍，抽濾，于30℃的干燥箱中烘干至恒重，研磨，分別獲15、30、45 d培養(yǎng)的竹蓀菌絲干品0.97、1.13、1.04 g。

1.3.2.2 竹蓀菌絲干品DBP的提取

分別準(zhǔn)確稱取15、30、45d竹蓀菌絲干品粉末0.5g（精確到0.000 1 g）至20 mL具塞磨口玻璃試管，加入5.0 mL乙酸乙酯，振蕩混勻，浸置30 min，在60℃的超聲條件下提取40 min，收集提取液，再加入5.0 mL乙酸乙酯重復(fù)提取2次，每次20 min，合并提取液，室溫下氮?dú)獯蹈?，乙酸乙酯定容?.0 mL，待GC-MS進(jìn)行分析測(cè)定，外標(biāo)法定量，然后進(jìn)行樣品含量計(jì)算。

1.3.2.3 空白培養(yǎng)液、培養(yǎng)液中DBP的提取

取0、15、30、45 d空白培養(yǎng)液與培養(yǎng)液，分別于80℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，移至50 mL具塞磨口錐形瓶中，按竹蓀菌絲干品相同步驟處理（提取過(guò)程中用到分液漏斗，將乙酸乙酯提取液與培養(yǎng)液分離），其測(cè)定分析方法同上。

1.3.3 氣相色譜條件

色譜柱：Agilent 19091S-433HP－5MS（325℃：30 m× 0.25 μm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度230℃；升溫程序：初始柱溫190℃，保持2 min，以10℃/min升溫至250℃，保持5 min，后運(yùn)行5 min，升至260℃，共運(yùn)行13 min；載氣（He，純度≥99.999%），流速1 mL/min；進(jìn)樣量：1.0 μL；分流比10∶1。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電子離源；電子能量70 eV，離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，乙酸乙酯提取物溶劑延遲2.50 min，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～500。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度x為橫坐標(biāo)，平均響應(yīng)值y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1），DBP標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程為y=26 021x-74 798，R2=0.999 9，證明DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在5.0 μg/mL～100.0 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖1 DBP標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of DBP

2.2 測(cè)定結(jié)果

經(jīng)GC-MS對(duì)空白培養(yǎng)液中的DBP進(jìn)行了5次平行分析測(cè)定。空白培養(yǎng)液中的DBP濃度為19.30μg/mL。

對(duì)不同時(shí)間的培養(yǎng)液以及竹蓀菌絲中的DBP分別進(jìn)行5次平行分析測(cè)定。測(cè)定試驗(yàn)用外標(biāo)法進(jìn)行定量，其測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1與表2。

表1 培養(yǎng)液中DBP的檢測(cè)結(jié)果Table 1 The results of DBP from culture medium

表2 不同生長(zhǎng)時(shí)間竹蓀菌絲提取液中DBP的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Analytical results of DBP from extracts of Dictyophora myceliums in different time

不同培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)液的DBP的濃度在17.71μg/mL～20.50 μg/mL范圍內(nèi)，其中30 d含量最高。培養(yǎng)液中DBP含量的波動(dòng)變化受菌絲的生長(zhǎng)影響。而在不同培養(yǎng)時(shí)間菌絲中的DBP的含量在28.86 mg/kg～33.52 mg/kg范圍，其中生長(zhǎng)30 d的菌絲中的DBP含量最低。

2.3 樣品加標(biāo)回收率與精密度試驗(yàn)

以30 d竹蓀菌絲干粉樣品減半量進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。按100%的供試品溶液濃度添加DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中添加濃度為10.87 μg/mL。按照試驗(yàn)相同條件及其步驟，平行測(cè)定9次，外標(biāo)法定量。計(jì)算回收率及其精密度（RSD），其測(cè)定結(jié)果如表3所示。樣品加標(biāo)回收率為95.4%～105.0%，其平均回收率為98.9%，RSD為3.4%。結(jié)果表明，該方法能夠滿足樣品的測(cè)定要求。

表3 竹蓀菌絲樣品中DBP添加回收試驗(yàn)結(jié)果及RSD（n=9）Table 3 Recoveries and RSDs of DBP spiked into Dictyophora mycelium（n=9）

3 結(jié)論與討論

DBP屬于PAEs中的一類重要化工原料，廣泛用于農(nóng)藥、殺蟲(chóng)劑、化妝品、香料等的生產(chǎn)中。因此，試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)盡量避免PAEs類化合物的污染。為了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度，試驗(yàn)前按試驗(yàn)提供的GC-MS分析條件，進(jìn)行了試劑空白試驗(yàn)，后續(xù)試驗(yàn)中所測(cè)得的試驗(yàn)均為扣除空白值。試驗(yàn)結(jié)果表明：空白培養(yǎng)液、不同培養(yǎng)時(shí)間的培養(yǎng)液以及竹蓀菌絲提取液中均含有DBP。

3.1 空白培養(yǎng)液中DBP含量及來(lái)源分析

在空白培養(yǎng)液提取液中被檢測(cè)到較高的DBP含量，濃度達(dá)19.30 μg/mL?？赡苁桥囵B(yǎng)基原料中的帶入，以及試驗(yàn)過(guò)程中培養(yǎng)基透氣封口膜和一次性過(guò)濾器的使用之故。

3.2 培養(yǎng)液中DBP的含量及變化分析

由于空白培養(yǎng)液本身存在一定的DBP物質(zhì)，所以培養(yǎng)液中也含有一定的DBP含量，濃度在17.71～20.50 μg/mL范圍，且與空白培養(yǎng)基的DBP濃度相比呈現(xiàn)降升降的趨勢(shì)，說(shuō)明在菌絲培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液中DBP含量受菌絲生長(zhǎng)的影響。

3.3 竹蓀菌絲中DBP的含量及變化分析

竹蓀菌絲中含有較高的DBP含量，含量在28.86mg/ kg～33.52 mg/kg范圍，含量呈現(xiàn)升降升的趨勢(shì)。表現(xiàn)為竹蓀菌絲生長(zhǎng)初期對(duì)環(huán)境中（培養(yǎng)基）的DBP具有一定的富集作用。隨著竹蓀菌絲生長(zhǎng)的進(jìn)行，本身也能夠產(chǎn)生一定量的DBP，并通過(guò)釋放到環(huán)境中（培養(yǎng)基）中，致使培養(yǎng)基的DBP含量升高，可能為實(shí)現(xiàn)環(huán)境的趨避作用。菌絲生長(zhǎng)后期，通過(guò)自生產(chǎn)生和對(duì)培養(yǎng)基中DBP的富集，致使菌絲中DBP的濃度反彈升高，導(dǎo)致菌絲中的DBP濃度遠(yuǎn)大于培養(yǎng)液中的DBP濃度。可能是生長(zhǎng)后期為實(shí)現(xiàn)趨避作用加強(qiáng)自生保護(hù)所致。

綜上所述，竹蓀菌絲在培養(yǎng)過(guò)程中，能產(chǎn)生一定量的DBP，并能可釋放一定濃度到環(huán)境中，也能一定程度地富集環(huán)境中的DBP，環(huán)境中和菌絲體內(nèi)DBP類代謝物的增加，能提高菌絲本身對(duì)蚊蟲(chóng)等的驅(qū)避作用。竹蓀菌絲產(chǎn)生和富集DBP的生物學(xué)功能，可作為制備綠色環(huán)保的生物驅(qū)避劑原料來(lái)源，拓展人們對(duì)竹蓀資源的開(kāi)發(fā)利用范圍。

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Determination and Analysis of Dibutyl Phthalate in Mycelium of Dictyophora

DING Bang-ju1，TANG Hong-min1，2，*
（1.College of National Medicine，Guizhou Minzu University，Guiyang 550025，Guizhou，China；2.Guizhou Institute of Ethnic Medicine，Guizhou Minzu University，Guiyang 550025，Guizhou，China）

To study the effects of Dictyophora mycelium on the accumulation of dibutyl phthalate（DBP），and determine the content of DBP from it in different growth stages.Through the external standard method and standard addition recovery experiment，the medium and blank medium as control groups，the DBP was separated from dried Dictyophora mycelium by ultrasonic-assisted solvent extraction method with ethyl acetate，and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）.The results showed that：（1）The regressione equation of calibration curve was y=26 021x-74 798，the correlative coefficient was 0.9999，and proof method had good linearity within 5.0 μg/mL-100.0 μg/mL range.The actual recoveries were 95.4%-105.0%，the average recovery was 98.9%，and relative standard deviation was 3.4%.（2）A certain amount of DBP was detected from the extracts of blank medium，and its concentration was 19.30 μg/mL.The concentration of DBP from medium in different time was in the range of 17.71 μg/mL-20.50 μg/mL，and the concentration of DBP in the Dictyophora mycelium was 28.86 mg/kg-33.52 mg/kg during the corresponding culture time.Dictyophora mycelium can produce and release a certain amount of DBP during the culture process，and also enrich the DBP in the environment.

Dictyophora；mycelium；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；DBP

2016-11-20

國(guó)家自然基金項(xiàng)目地方基金項(xiàng)目（31160013）；貴州民族大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目（201415）

丁邦菊（1992—），女（侗），在讀碩士，研究方向：民族傳統(tǒng)醫(yī)藥。

*通信作者：湯洪敏（1969—），女（漢），教授，博士，研究方向：種質(zhì)資源保護(hù)。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.028