線辣椒SSR-PCR反應體系優化及多態性標記篩選

李全輝，李 江，邵登魁，王亞藝，侯全剛，鐘啟文

(青海大學 農林科學院，西寧 810016)

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線辣椒SSR-PCR反應體系優化及多態性標記篩選

李全輝，李 江，邵登魁，王亞藝，侯全剛，鐘啟文

(青海大學 農林科學院，西寧 810016)

以循化線辣椒果實黃色突變體H0809和高代自交系0599-1為試材，采用L9(34)正交試驗設計，研究線辣椒SSR-PCR 反應體系的主要成分對擴增結果的影響，并對420對SSR分子標記進行篩選。結果表明，最優的反應體系為：總體積20 μL，基因組DNA 20 ng，dNTP 100 μmol·L-1,引物0.6 μmol·L-1, Mg2+2.5 mmol·L-1,TaqDNA聚合酶1.5 μmol；通過篩選，獲得72對具有多態性的SSR標記，多態性率為17.1%，平均每個標記擴增出2. 67個等位基因。本試驗建立的SSR-PCR反應體系和篩選的多態性標記可用于線辣椒種質資源分析、分子標記輔助育種、分子遺傳圖譜構建及基因克隆等研究。

線辣椒；SSR；體系優化；引物篩選

簡單重復序列(Simple Sequence Repeats, SSR)又稱微衛星(Microsatellites)，是一類有1～5個核苷酸可變次數的串聯重復序列。SSR由于具有數量豐富、多態性高、呈共顯性遺傳、實驗操作簡單以及對DNA數量和質量要求不高等優點, 目前已廣泛應用于種質資源的遺傳多樣性分析[1-2]，雜交種純度鑒定[3-5]、遺傳連鎖圖譜構建及性狀定位[6-9]等各個領域。在辣椒全基因組測序基礎上，利用辣椒基因組富集文庫和公共數據庫的cDNA序列，開發了很多的SSR標記[10-11]，為相關應用奠定基礎。

辣椒屬茄科(Solanaceae)辣椒屬(Capsicum)，是一種重要的蔬菜作物，適應性很強，廣泛栽培于世界各地。中國作為世界上最大的辣椒生產國家之一，目前年播種面積可以達130 多萬hm2，且種植面積還在不斷加大，已成為農民致富的主要經濟作物之一[12]。對辣椒重要性狀進行連鎖標記篩選及遺傳定位研究，不僅可以加快育種時間，同時節省成本，對辣椒育種實踐具有重要的意義。本試驗以線辣椒為材料，建立穩定的、適合線辣椒的SSR分析體系，以期為利用SSR分子標記進行線辣椒分子標記輔助育種，并為后續品質、產量等相關數量性狀的QTL定位研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用青海省地方品種循化線辣椒果實黃色突變體H0809(黃色)和高代自交系 0599-1為試材。

1.2 試劑和儀器

辣椒基因組DNA用天根公司的植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)提取， SSR引物由上海生工生物工程公司合成(由中國農業科學院蔬菜花卉研究所辣椒課題組提供),TaqDNA聚合酶、 dNTPs為天根公司產品，PCR 儀為Eppendorf Mastercycler pro 梯度 PCR 儀，電泳儀為BIO- RAD 公司生產的Power Pac3000型。成像儀為BIO- RAD公司的GelDoc XR System凝膠成像系統。

1.3 PCR 擴增反應和電泳檢測

PCR反應體系為20 μL；PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火60 s，72 min延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。

1.4 PCR反應體系優化

采用L9(34)正交試驗設計，各因素和水平在參照辣椒[13]，黃瓜[14]等的SSR體系的基礎上進行優化，試驗方案見表1及表2。基因組DNA來自H0809，引物為HpmsE004。此外，體系中應含有1×PCRbuffer和50 ng基因組DNA，加ddH2O補足20 μL。設3次重復。

表1 線辣椒SSR- PCR反應體系正交設計因素水平表Table 1 Factors and levels of SSR-PCR system of pepper with orthogonal design

表2 SSR- PCR正交試驗設計方案Table 2 SSR-PCR orthogonal design

1.5 DNA底物質量篩選

在體系優化的基礎上，進行DNA底物質量篩選試驗，共設100 ng、80 ng、60 ng、40 ng、20 ng、10 ng 6個處理。選用黃色線辣椒H0809的基因組DNA，引物為HpmsE004。

1.6 體系穩定性檢測和多態性SSR引物的篩選

選擇8對SSR引物同時對H0809和0599-1的基因組DNA進行PCR 擴增, 對優化后的辣椒反應體系及反應參數的可靠性和穩定性進行檢測。在此基礎上，采用420對 SSR引物進行多態性篩選，擴增結果用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 DNA質量檢測

利用天根植物基因組提取試劑盒提取線辣椒H0809和0599-1的基因組DNA , 用Bio-Photometer核酸檢測儀檢測DNA 溶液濃度和純度, 其檢測結果OD260/OD280值為1.80～1.89, 說明DNA 純度較高。用瓊脂糖檢測DNA檢測結果表明條帶整齊, 沒有拖尾現象, 說明提取的DNA完整而且沒有降解, 可以用于SSR標記分析(圖1)。

M. Maker; 1. H0809基因組DNA H0809 genomic DNA; 2. 0599-1基因組DNA 0599-1 genomic DNA
圖1 線辣椒基因組DNA
Fig.1 Pepper genomic DNA

2.2 SSR- PCR反應體系的正交試驗優化

SSR-PCR體系的Mg2+、dNTPs 、引物、TaqDNA聚合酶、基因組DNA用量和擴增循環次數等因素都會影響擴增效果，本研究選用黃色線辣椒H0809的DNA 為模板, 利用引物組合HpmsE004來進行各個因素梯度正交試驗。由圖2可以看出，不同處理組合擴增效果存在明顯的差異。1、4、6、7、8組合擴增結果經瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶較弱，組合9沒有檢測到擴增產物，組合2、5擴增的條帶較為清晰完整，組合3除主要條帶外，在500 bp出，還擴增出另一條帶，而且重復性較好。綜合考慮，本試驗選擇第3組合為最佳組合，即dNTP 100 μmol·L-1,引物0.6 μmol·L-1, Mg2+2.5 mmol·L-1,TaqDNA聚合酶1.5 μmol。

M. Maker；1～9. 正交試驗各處理組合號，3次重復 Treatment 1-9 denoted in table 2,repeat three times
圖2 正交試驗SSR-PCR反應擴增結果
Fig.2 The amplified results of each treatment according to the orthogonal design

2.3 基因組DNA用量篩選

用模版100 ng、80 ng、60 ng、40 ng、20 ng 、10 ng 6個處理進行梯度試驗，結果見圖3，可以看出，不同的質量都能擴增到完整的條帶，擴增效果在20～100 ng差異不明顯，模版用量在10 ng時，擴增條帶較弱。因此，從試驗可靠性及經濟性出發，選用體系模版用量為20 ng。

M. Maker; 1～6. 模版DNA用量分別是100 ng、80 ng、60 ng、40 ng、20 ng 、10 ng The amount of template DNA was 100 ng，80 ng，60 ng，40 ng，20 ng ，10 ng
圖3 不同模版用量的PCR擴增
Fig.3 Result of PCR with different amount of DNA template

2.4 SSR-PCR反應體系穩定性檢測和多態性標記篩選

2.4.1 SSR-PCR反應體系穩定性檢測 隨機選取8對SSR引物，分別為HpmsE008、HpmsE036、HpmsE056、HpmsE106、GP20095、GPMS 203、ES64、ES137， 以H0809和0599-1為模版，用最佳組合進行體系穩定性檢測。結果如圖4所示，選擇的8 對引物均能擴增出清晰譜帶，表明優化的辣椒SSR-PCR反應體系是穩定可靠的。

2.4.2 多態性標記篩選 以黃色線辣椒H0809及高代自交系0599-1為為材料，用篩選出的最佳SSR-PCR體系進行引物篩選(圖5)。結果從420個SSR標記中，篩選出72對具有多態性、擴增質量好的標記。部分SSR標記的的多態性信息見表3。72對SSR標記在2份辣椒種質材料中共擴增出192個等位基因，平均每對引物能檢測到2.67 個等位基因。

M. Maker;1～8.HpmsE008，HpmsE036，HpmsE056，HpmsE106，GP20095，GPMS 203，ES64，ES137
圖4 最佳組合對8對SSR引物的擴增結果
Fig.4 Amplification effects of using 8 pairs of SSR primers with optimized SSR system

3 結論與討論

隨著辣椒基因組測序以及高通量測序技術的發展，基于全基因組開發的SSR標記及EST-SSR標記數量日益豐富。劉峰等[11]基于公共數據庫開發出大量的SSR標記，并在品種鑒定及改良、資源分析、遺傳圖譜構建、功能基因發掘等方面得到廣泛應用[15-17]。因此，建立穩定的SSR-PCR體系，是SSR標記技術在線辣椒開展相關研究的基礎。

本研究對影響辣椒SSR反應的dNTPs、Mg2+、引物、TaqDNA聚合酶及模板DNA濃度等因素進行分析，確定出線辣椒SSR-PCR的最佳體系為：總體積20 μL，dNTP 100 μmol·L-1,引物0.6 μmol·L-1, Mg2+2.5 mmol·L-1,TaqDNA聚合酶1.5μmol以及基因組DNA 20 ng。 目前多數研究認為Mg2+濃度決定TaqDNA聚合酶的活性, 濃度過低時, 酶活力顯著降低, 濃度過高則催化非特異片段的擴增[13-14]。本研究結果顯示的Mg2+濃度對SSR- PCR 擴增的影響與上述結論一致。同時可以看出dNTP濃度在100～300 μmol·L-1時對反應體系影響不大。引物濃度是影響PCR 擴增的一個重要因素，引物濃度過高，容易產生非特異性擴增和高含量引物二聚體，還易引起堿基錯配；引物濃度過低，則易產生拖尾現象和導致擴增產量下降[18]，佟海申等[19]的研究發現引物濃度對擴增結果的影響最大，本試驗結果未能反映出上述結論，可能與設計的引物濃度梯度差異不大有關，第9組合可能由于TaqDNA聚合酶濃度過低，沒有擴增出條帶。

本研究利用黃色線辣椒H0809和高代自交系0599-1對420對SSR標記進行篩選，結果顯示，72對SSR標記具有多態性，擴增質量較好，多態性率為17.1%。相比較劉峰等[11]在辣椒中篩選的36.84%、蘇輝等[20]在豆中篩選的37%的SSR標記多態性率，本試驗相對偏低，推測可能與親本材料的遺傳距離相對較近有關系；同時平均每個標記擴增出2.67個等位基因，這跟羅玉娣等[21]平均每對SSR引物檢測到2.6個，周晶等[22]平均每對引物可擴增出2. 66個等位基因變異的結果基本一致。但低于劉峰等[11]平均每對引物4.42個、何建文等[4]平均每對引物可檢測3.8個等位基因。

本試驗建立的辣椒的SSR-PCR體系，通過對部分SSR標記進行擴增，得到較為清晰、完整、可靠條帶，說明該體系可以用于線辣椒SSR-PCR分析；通過篩選，得到的72對多態性標記為今后線辣椒種質資源分析、分子標記輔助選擇、分子遺傳圖譜構建及相關基因克隆等奠定了基礎。

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(責任編輯：成 敏 Responsible editor:CHENG Min)

Optimization of SSR-PCR Reaction System and Selection for Polymorphic Primers in Chili Pepper(Capsicumannuumvar.longunt).

LI Quanhui, LI Jiang, SHAO Dengkui, WANG Yayi, HOU Quangang and ZHONG Qiwen.

(Academy of Agriculture and Forestry，Qinghai University，Xining 810016，China)

In the study, the factors affecting the SSR-PCR results of pepper were studied with L9(34) orthogonal design, and the polymorphism of 420 primer pairs were screened by yellow pepper fruit mutant HJ2002 and high generation inbred 0599-1. The results showed that optimal reaction system was the total 20 μL reaction system containing 20 ng of DNA template, 100 μmol·L-1dNTP, 0.6 μmol·L-1primer, 2.5 mmol·L-1Mg2+and 1.5 μmol ofTaqDNA polymerase enzyme. All the 420 primer pairs were selected at random for yielding amplification products, of which 72 primer pairs showed polymorphism between two different pepper varieties. The polymorphism rate was 17.1% while the average alleles per locus was 2.67.This optimized SSR-PCR system and polymorphism primer could be applied for further research on germplasm analysis, molecular marker-assisted breeding, construction of molecular genetic linkage maps and gene cloning in chili pepper.

Capsicumannuumvar.longunt; SSR; System optimization; Primer screening

2016-10-23 Returned 2016-11-21

Middle Youth Foundation of the Academy of Agriculture and Forestry, Qinghai Province(No.2014-NKY-04); Genetics and Physiology Key Laboratory Project of Qinghai Province.

LI Quanhui,research assistant,doctoral student.Research area：genetic breeding and molecular biology in vegetable crop.E-mail:liquanhui_2008@163.com

日期：2017-06-29

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170629.1108.026.html

2016-10-23

2016-11-21

青海省農林科學院中青年基金(2014-NKY-04)；青海省遺傳與生理重點實驗室項目。

李全輝，男，助理研究員，在職博士，研究方向為蔬菜作物遺傳育種與分子生物學。E-mail:liquanhui_2008@163.com

S641.3

A

1004-1389(2017)07-1047-07