大豆矮化突變體苗期表型觀察及對外源激素的響應

李元龍 ，王中華 ，馮獻忠

(1.西北農林科技大學 農學院，陜西楊凌 712100；2.中國科學院 東北地理與農業生態研究所，長春 130000)

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大豆矮化突變體苗期表型觀察及對外源激素的響應

李元龍1，王中華1，馮獻忠2

(1.西北農林科技大學 農學院，陜西楊凌 712100；2.中國科學院 東北地理與農業生態研究所，長春 130000)

以‘菏豆12’及其60CO-γ射線誘導矮化突變體為材料，研究突變體的第一復葉葉柄長度、苗期株高、葉柄顯微結構，利用4種外源激素處理根系，初步探查突變基因的類型。結果表明：該突變體葉柄比野生型短，株高矮，整體緊湊。葉柄橫切觀察發現，該突變體木質部細胞及髓細胞直徑變小。根系對6-芐氨基嘌呤(6-BA)、赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)非常敏感，對油菜素內酯(BR)無應答，表明該突變體可能是BR信號轉導出現障礙，后續目標基因發掘應圍繞BR信號轉導途徑的相關基因展開。矮化短葉柄突變體在大豆理想株型改造與大豆分子育種中可能具有潛在利用價值。

大豆；矮化突變體；短葉柄；根系；植物外源激素；顯微結構

高產是大豆育種的重要目標，受谷物的“綠色革命”啟示，通過適度降低大豆株高，高密度種植可提高植株的水分利用效率，從而增加大豆的單位面積產量[1]。研究表明，大豆矮桿、短葉柄可以改變大豆冠層結構，形成緊湊的株型，可以在高密度種植的前提下，最大限度地提高群體光能利用率而增加產量[2]。對于大豆矮桿、短葉柄的研究最早始于1983年，Kilen發現1個大豆矮桿、短葉柄突變體‘D76-1609’,其與長葉柄大豆‘Lee68’雜交，遺傳分析表明該短葉柄性狀受1對隱性基因控制, 命名為lps[3]。1998年，南京農業大學大豆研究所發現新型大豆短葉柄突變體‘NJ90L-1SP’，表現為短葉柄且葉枕異常。遺傳研究發現這兩個性狀受2對隱性重疊基因 lps1和 lps2控制[4]。2009年，Jun等發現1個大豆短葉柄突變體——‘SS98206’，經過遺傳分析后發現其基因與‘D76-1609’短葉柄基因lps不是等位基因。且其表型與‘NJ90L-1SP’的表型明顯不同，故命名該基因為 lps3[5]。由此可見，培育和研究矮化、短葉柄大豆突變體一方面豐富了大豆的遺傳資源；另一方面對于培育大豆理想株型、高密種植來提高產量具有重要意義。

許多研究表明植物矮化多是由某一植物激素無法合成或某一植物激素作用通路受阻所致[6-7]。在豌豆矮化突變體1 kb中存在GA信號轉導異常和IAA合成缺陷[8]。在番茄中與BR合成相關的dwarf基因突變造成植株矮化[9]。Sasaki等[10]對1個GA不敏感水稻矮化突變體研究發現，GID1和GID2與GA信號轉導相關。張達對矮化大豆突變體‘東澤11號’的激素處理研究和李葳對矮桿及半矮桿大豆突變體的激素處理研究都證明GA3與大豆矮化存在正相關聯系[11-12]。矮化植株的細胞學研究發現，矮化表型主要由于細胞數目減少或細胞間隙變小，細胞長度變短所致。多種激素間存在復雜的相互作用且均會影響植物發育。GA可以影響細胞分裂的某個階段促進細胞分裂的進程和細胞壁長軸以及微管的伸長[13]，IAA可促進GA1的生物合成，抑制GA1向無活性的GA29轉化[14]。BR在促進植株生長的過程中具有縱向伸長和橫向擴展的雙重作用，作用機制既不同于IAA，也不同于GA[15]。由此可見，激素與矮化、短葉柄性狀有緊密的關系。

本研究對60CO-γ射線誘變‘菏豆12’產生的1個矮化短柄突變體的株高、葉柄長度進行動態觀測，對葉柄進行顯微觀察。為了研究該突變體與激素的關系，采用4種激素處理來檢測突變體與野生型‘菏豆12’的表型差異，為進一步研究該大豆矮化、短葉柄性狀的調控基因功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆突變體由‘菏豆12’經60CO-γ誘變而來，由中國科學院東北地理與農業生態研究所提供。野生型大豆‘荷豆12’由山東省菏澤市農科所選育。

所用植物激素有6-芐氨基嘌呤(6-BA)，赤霉素(GA3)，吲哚乙酸(IAA)，油菜素內酯(BR)。使用1/2 MS培養液(MS 2.165 g，蔗糖15 g，調節pH=5.8)配制4種植物激素的所需濃度。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆幼苗株高和葉柄長度測量 挑選飽滿、大小一致的突變體和‘菏豆12’種子，進行溫室盆栽，從出苗后第10天開始，即第1片三出復葉完全展開，每隔3 d測量1次株高與第1片三出復葉葉柄長度，各取3株重復，共測量6次，每次測量3次取平均值，繪制生長曲線。

1.2.2 大豆突變體葉柄橫切觀察 材料取自成熟突變體和野生型‘菏豆12’植株上第4片復葉葉柄中間部位。各3個重復，置于FAA固定液中48 h，沖洗后備用，采用常規石蠟制片方法，切片厚度10 μm。番紅固綠染色。阿拉伯樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察拍照。各項數據測量取3個重復的“平均值±標準差”。

1.2.3 大豆突變體根系在不同激素處理反應 試驗材料種植與管理：挑選飽滿、大小一致的突變體和‘菏豆12’種子，用氯氣(200 mL次氯酸鈉+40 mL濃鹽酸)熏蒸一夜，取出敞口放在超凈工作臺上吹0.5 h，封口放置2 d后分別放于無菌培養皿中，加適量無菌水，將培養皿封口放于37 ℃培養箱中，進行浸種處理(約60 h)；將露出胚根的大豆，胚根向下依次放入Phytotc培養袋(北京啟維益成科技有限公司)中，每個培養袋加入10 mL相應濃度的植物激素營養液。放于空氣相對濕度為60%的培養室，設置溫度(26 ℃光/24 ℃暗)和光照(13 h光/11 h暗)條件。每天向培養袋添加5 mL相應濃度的植物激素營養液，保持生長袋濕潤。培養6 d后，觀察根系生長情況。

外源激素濃度設置：對突變體和‘菏豆12’的種子同時設置4種外源植物激素處理，分別為IAA、6-BA、GA3、BR，每種植物激素設置3個濃度梯度處理，0.1、1、5 μmol/L，每個處理設3個重復。野生型與突變體對照組只用1/2 MS營養液處理。

2 結果與分析

2.1 突變體株高與葉柄長度的變化

從圖1可以看出，突變體第一片葉葉柄長度明顯短于野生型，且長度變化并不明顯，平均只增長0.70 cm，而野生型的葉柄的伸長非常明顯，大約是突變體的4倍，平均增長2.733 cm。突變體植株株高在出苗10～13 d增長顯著，之后增長緩慢。野生型株高在全時期增長明顯，在出苗后19～21 d增幅最大。以上結果表明，突變體的生長速度要弱于野生型。

2.2 葉柄顯微結構觀察

大豆葉柄橫切從外到內依次是表皮、皮層、維管束、髓。具有多個維管束列，以大型維管束和小型維管束交替相間的方式環形排列，維管束類型為外韌維管束。通過顯微觀察發現，突變體葉柄表皮細胞，皮層細胞的大小形態與野生型差異不大，維管束個數與野生型類似，大致為13個。突變體葉柄中大型維管束管孔鏈數為3～4列，野生型中為3～5列(圖2)。在細胞直徑大小方面，突變體葉柄木質部導管細胞和髓細胞直徑都顯著小于野生型(P<0.05)，野生型木質部導管平均直徑為23.88 μm，而突變體木質部導管細胞平均直徑只有19.26 μm。野生型髓細胞較突變體發達，細胞直徑普遍較大，其中大于100 μm的有10個左右，而突變體中只有4個左右(表1)。綜上所述，突變體大豆葉柄在整體的顯微組成結構上相比于野生型無變化，但木質部細胞及髓細胞直徑較野生型小，這可能由于突變體中細胞的橫向發育能力下降所致。

2.3 外源激素處理對突變體根部的影響

早前研究表明，植物矮化與多種植物激素如GA、BR、IAA、6-BA有關[16]。主根長是評價根系生長發育的重要指標。本研究用4種植物激素處理該突變體根系，用主根長的變化判斷突變是否與某種激素有關。

從圖3得出，突變體主根長在應對不同濃度GA3、6-BA、IAA處理時的變化趨勢與野生型類似。這表明突變體在應答模式上與野生型相同。不同的是，在0.1 μmol/L的GA3、6-BA、IAA低濃度處理下均會對突變體主根長產生顯著影響，而對野生型影響不大。這可能是突變體在各激素旁系通路或激素平衡機制上出現異常，導致對低濃度激素敏感。在1和5 μmol/L的6-BA、IAA處理下，對突變體的促進率明顯大于野生型。GA3與此相反(圖3-Ⅱ)。

誤差線為標準偏差；多重比較采用Duncan’s新復極差法，不同的大寫字母為野生型內差異顯著(P<0.05)，不同的小寫字母為突變體內差異顯著(P<0.05)，下同 The error bar is the standard deviation;based on Duncan ’s multiple comparison test, different capital letters mean significant difference among various periods in wild type(P<0.05), different small letters mean significant difference among various periods in mutant type(P<0.05),the same below
圖1 野生型與突變體大豆株高和葉柄長度動態比較
Fig.1 Dynamic comparison of plant height and petiole length between wild type and mutant type

左圖為野生型葉柄橫切(10×)，右圖為突變體葉柄橫切(10×) The wild type petiole crosscutting on the left, The mutant type petiole crosscutting on the right
圖2 野生型與突變體大豆葉柄橫切(10×)
Fig.2 Soybean petiole crosscutting between wild type and mutant type

表1 野生型與突變體葉柄橫切顯微結構Table 1 Petiole crosscutting microstructure between wild type and mutant type

注：多重比較采用Duncan’s新復極差法，*和**分別表示差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)。
Note：Based on Duncan’s multiple comparison test, * and ** means significantly different at theP<0.05 andP<0.01respectively.

從BR處理結果可以看到，突變體大豆主根長的變化與野生型大豆主根長的變化有明顯差別(圖3-Ⅳ)。0.1 μm的BR處理對主根長的促進作用還并不明顯，但在1 μm的BR處理下，野生型大豆主根長長度有明顯增加，且對主根長伸長的促進效果是所有激素處理中最大的。隨著外源BR濃度的升高，促進作用有所下降，但仍具有顯著性差異。這表明正常大豆主根長長度是會隨著外源BR濃度的變化而變化的，并會受到外源BR的強烈促進。但與此不同的是，在突變體中，無論何種濃度的BR處理都不會對主根長產生影響，突變體根系喪失對外源BR濃度變化的響應，這表明該大豆突變體根系存在應答BR信號通路上的缺陷，這種缺陷是造成該大豆突變體表型的主要原因。

Ⅰ.6-BA處理 6-BA hormone treatment；Ⅱ.GA3處理 GA3hormone treatment；Ⅲ.IAA處理 IAA hormone treatment；Ⅳ.BR處理 BR hormone treatment
圖3 不同激素處理對突變體大豆與野生型大豆根系的影響
Fig.3 Effects of different phytohormones on soybean root growth between wild type and mutant type

3 討 論

新育大豆突變體株高變矮，葉柄縮短，整體呈現緊湊株型特征，葉柄木質部導管細胞和髓細胞直徑明顯小于野生型。該突變體與表現為株高和節間縮短、葉柄長短不變的矮化突變體‘東澤11號’是不同類型的突變體；與大豆短葉柄突變體‘D76-1609’‘NJ90L-1SP’和‘SS98206’的關系還需進一步確認。

該突變體對外源激素BR響應異常，說明該大豆矮化短柄突變體存在BR信號轉導途徑上的缺陷。BR信號轉導受阻將導致細胞橫向生長能力和分裂能力下降[17]，這與葉柄切片的觀察結果相符。對BR信號轉導的研究表明，同一受體蛋白會存在于多種植物激素信號轉導通路中，形成特殊的植物激素平衡機制，維持彼此含量平衡[18]。該突變體對低濃度6-BA、IAA、GA3敏感，這可能是該突變體中某些激素平衡被打破，激素間互作異常所致。

目前，與BR信號轉導相關研究已有報道。在擬南芥中DWF1蛋白是一種Ca2+/CAM結合蛋白，當DWF1蛋白與CAM不能正常結合時，就會表現為矮化表型[19-20]。并且已發現多個編碼BR信號轉導蛋白的基因，如 bri1、 cbb2等和多個參與BR信號轉導的蛋白如bri1，V-ATPase等，其中 bri1基因編碼的bri1蛋白是BR信號轉導途徑中最主要的成分，這種蛋白是膜受體蛋白，具有ser/thr激酶活性，參與下游信號的傳遞[21]。而在單子葉模式植物水稻中，與BR合成相關基因有 brd1、brd2等[22-23]，參與BR信號轉導的基因有 d10、 d10等[24-25]， BR信號轉導受體蛋白有3個，分別是Osbri1、OsBRLl、OsBRL3，其中OsBRI1的功能缺失會導致對BR的不敏感[26]，另外在水稻BR不敏感型突變體‘d10-4’[27]的研究中發現，有一種名為PCAM的蛋白表達上調，這表明PCAM在BR的信號轉導途徑中起負調控作用[28]。本研究鑒定的突變體到底是哪個基因發生突變，還有待進一步研究。

本矮化短柄大豆突變體作為矮化大豆遺傳資源，對于挖掘與株型性狀相關基因功能、大豆理想株型構建和大豆分子育種中都具有潛在價值。

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(責任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Phynotypic Observation and Response to Exogenous Hormones in a Soybean Dwarf-mutant at Seedlings Stage.

LI Yuanlong1,WANG Zhonghua1and FENG Xianzhong2.

(1.College of Agronomy, Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100, China; 2.Northeast Institute of Geography and Agroecology, Chinese Academy of Sciences, Changchun 130000, China)

We adopted the mutant soybean which was generated by the60CO-γ ray induce ‘Hedou 12’. Comparative study on the first compound leaf petiole length, seedling plant height and petiole microstructure between wild type and mutant type. In order to explore preliminarily the type of mutation gene, four different hormone treatments were carried out on roots. Result shows that the mutant type has shorter petiole length and lower plant height compared with the wild type, as well as, present a compact phenotype. Petiole crosscutting observation reveal that the mutant cells of xylem and pith become smaller. The mutant roots were very sensitive to 6-BA, GA3, IAA, However, had no response to BR, indicating that the mutant might be BR signal transduction disorder, subsequent target gene discovery should be based on the related genes of BR signal transduction pathway. Soybean dwarf short petiole mutant may have potential application value in the soybean ideotype transformation and soybean molecular breeding.

Soybean; Dwarf mutant; Short petiole; Roots; Plant exogenous hormones; Microstructure

2016-09-04 Returned 2016-09-13

The National Natural Science Foundation of China(No.31571692):Northwest Agriculture and Forestry University Tang Zhongying Breeding Fund Project.

LI Yuanlong, male,master student. Research area:crop genetics and breeding.E-mail:845686931@qq.com.

WANG Zhonghua, male,Ph.D,doctoral supervisor,professor.Research area:crop genetics and breeding. E-mail: zhonghuawang@nwsuaf.edu.cn

日期：2017-06-29

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170629.1107.006.html

2016-09-04

2016-09-13

國家自然科學基金(31571692)；西北農林科技大學唐仲英育種基金。

李元龍，男，碩士研究生，研究方向為作物遺傳育種。E-mail：845686931@qq.com 通信作者：王中華，男，博士，博導，教授，研究方向為作物遺傳育種。E-mail：zhonghuawang@nwsuaf.edu.cn 馮獻忠，男，博士，博導，研究員，研究方向為大豆功能基因組學、系統生物學、分子設計。E-mail：fengxianzhong@neigae.ac.cn

S529

A

1004-1389(2017)07-1014-06

FENG Xianzhong, male,Ph.D,doctoral supervisor,research fellow.Research area:functional genomics of soybean, systems biology. E-mail:fengxianzhong@neigae.ac.cn