豬流行性腹瀉病毒 ORF3基因的克隆及序列分析

易華山，畢俊萱，馬鮮平，唐明霞，張德志，王芝英

(西南大學 榮昌校區動物醫學系，重慶 402460)

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豬流行性腹瀉病毒 ORF3基因的克隆及序列分析

易華山，畢俊萱，馬鮮平，唐明霞，張德志，王芝英

(西南大學 榮昌校區動物醫學系，重慶 402460)

為研究2015年重慶市榮昌部分腹瀉豬場是否有豬流行性腹瀉病毒的感染與流行，對豬流行性腹瀉病毒 ORF3(Open reading flame 3)基因進行克隆及序列分析研究。通過從疑似流行性腹瀉病毒感染的豬場采集小腸組織，采用RT-PCR方法對豬流行性腹瀉病毒的 ORF3基因進行克隆。結果表明，所獲得的 ORF3基因ORF長675bp，編碼223個氨基酸。通過DNAMAN軟件分析，表明本研究中克隆的 ORF3基因與CV777標準株(AF353511)的 ORF3基因相似性為96.45%，與中國的NJ(KJ642645)的相似性最高，為99.41%，與attenuated DR13疫苗株(EU054930)相似性90.52%，而與CV777疫苗株(GU372744)相似性僅79.07%。系統進化樹分析表明，該基因與中國毒株、韓國毒株以及美國分離株USA/ Illinois 201/2014 (KR265795)處于同一進化分支上，而attenuated DR13疫苗株、CV777 truncated疫苗株和歐洲的CV777標準株處于另一個進化分支上，說明該基因與中國毒株、韓國毒株的遺傳距離最近。通過 B細胞抗原表位預測分析，發現其氨基酸第65～68、114～116、137～140和150～154區域可能有潛在的優勢抗原表位。成功克隆了豬流行性腹瀉病毒 ORF3 基因，說明2015年重慶市榮昌部分腹瀉豬場存在豬流行性腹瀉病毒的感染。

豬流行性腹瀉病毒； ORF3基因；序列分析

豬流行性腹瀉( porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒( porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種急性接觸性腸道傳染病[1]。PED是世界范圍內發生與流行的豬病之一，1971年在英國首次被報道；此后，在多個國家和地區相繼報道PED，如比利時、中國、韓國等[2-4]。有研究表明，在中國南部許多省份爆發PED，超過100萬的仔豬死亡，且出生后7 d內的仔豬死亡率高達80%～100%[1-6]。現已研制出的PEDV疫苗對該病的流行在一定程度上起到控制作用，但由于PEDV新變異株的不斷出現，疫苗并不能完全阻斷該病的發生，給世界養豬業造成巨大的經濟損失[4-6]。

PEDV由6個基因組成：纖突基因、小包膜基因、膜基因、核衣殼基因、復制酶基因和 ORF3基因，其中 ORF3基因為非結構基因，長675 bp，編碼223個氨基酸，也是PEDV唯一的輔助基因[1-2]。不同PEDV毒株的 ORF3基因存在著不同的可變區，有短的核苷酸缺失(2～7 bp)，這使 ORF3具有多形態[6-8]。Park等[9]克隆16個PEDV不同毒株的 ORF3基因，通過比較野生型和致弱毒株，發現致弱的毒株均缺失17個氨基酸(51個核苷酸)，推測這是和病毒毒力有關的重要位點。有研究發現 ORF3基因編碼一種調節病毒復制的鉀離子通道蛋白，但鉀離子通道蛋白影響病毒致病性的機制還有待更深入的研究[10]。PEDV與其他冠狀病毒相比，仍有許多研究還不夠深入[11-12]。本試驗對豬流行性腹瀉病毒的 ORF3基因進行克隆和序列分析，為進一步分析豬流行性腹瀉病毒的分子特征及分子流行病學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病 料 于2015年12月從榮昌疑似流行性腹瀉病毒感染的豬場采取小腸樣品，置于液氮中保存待用。

1.1.2 主要試劑 pGEM-T easy載體購自美國promega公司，RNeasy Mini Kit購自QIAGEN公司，DNA片段純化試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，B型質粒小量快速提取試劑盒購自Axygen公司。AMV反轉錄酶、dNTP、RNA酶抑制劑、DNA Marker、X-gal和T4DNA連接酶、以及rTaqDNA聚合酶等均購自寶生物(大連)工程有限公司；其他試劑均為進口或國產分析純。

1.1.3 引物設計 參照GenBank收錄的豬PEDV CV777 ORF3基因序列 (AF353511)設計并合成引物PEDV ORF3 F1和PEDV ORF3 R1，用于擴增從ATG到TAA一個完整閱讀框的 ORF3基因。引物PEDV ORF3 F：5′-ATGT-TTCTTGGACTTTTTCA-3′，PEDV ORF3 R：5′-TCATTCACCAATTGTAGCATAC-3′。以上引物均由北京華大生物有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 病料處理及組織RNA的提取 取出300 mg液氮中保存的小腸組織置于液氮預冷的研缽中，加入液氮進行充分研磨，取1/3粉未于無RNA酶的EP管中，加入800 μL Trizol，顛倒混勻10次，按照RNeasy○RMini Kit操作說明提取總RNA。

1.2.2 RT-PCR 對提取總RNA以OligdT及試劑盒隨機引物，用反轉錄酶M-MLV，按照試劑盒說明書進行反轉錄，合成cDNA，再以cDNA為模板，以ORF3 F1和F2為引物進行PCR擴增。PCR反應條件：94 ℃ 5 min，1個循環；94 ℃ 45 s，54 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環，最后72 ℃再延伸10 min。RT-PCR產物于0.01 g/mL的瓊脂糖凝膠中電泳后，按Axygen quick Gel Extraction Kit的說明書進行純化并將純化產物與PGEM-Teasy連接，連接產物轉化Trans T1感受態細胞，經藍白斑篩選重組質粒，按質粒小量快速提取試劑盒提取質粒，進行PCR鑒定。

1.2.3 目的基因氨基酸序列比對與結構預測分析 將鑒定正確的重組質粒送北京華大生物工程公司測序，利用Blast在NCBI網站進行序列相似性比對分析；利用在線ExPASy和TMpred進行蛋白理化性質及跨膜結構域預測(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/htmL/page.cgi?id=index;http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func= modelling_simple1;http://www.ebi.ac.uk/interpro/index.htmL)。多序列比對采用Clustal W和Muscle.exe軟件進行，再用MEGA5.0軟件中的Boot-strapped Neighbor-Joining繪制 ORF3基因進化樹分析。應用DNAMan軟件對 PEDV ORF3核苷酸序列進行相似性比對；應用DNAStar軟件中的Protean程序預測PEDV ORF3的B細胞抗原表位及利用CBS Prediction servers的TMHMM(http:// www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/)預測PEDV ORF3蛋白的跨膜區。

2 結果與分析

2.1 PEDV ORF3基因RT-PCR

PEDV ORF3基因經過0.01 g/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示大約在700 bp處有特異性條帶，與預期結果一致(圖1)。

M.DL-5000 Marker；1.目的基因PCR產物 Target gene PCR product
圖1 PEDV ORF3基因的PCR產物擴增
Fig.1 RT-PCR Amplification of PEDV ORF3 gene

2.2 PEDV ORF3基因菌液PCR鑒定

以陽性克隆的重組菌液為模板，以ORF3 F1和F2為引物進行PCR反應，產物經0.01 g/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示大約在700 bp處有特異性條帶，表明重組質粒中含有目的基因片段(圖2)。

2.3 測序及序列分析結果

2.3.1 PEDV ORF3基因序列測定及系統進化分析 經測序表明PEDV ORF3基因的長度為675 bp，共編碼223個氨基酸。將PEDV ORF3基因的氨基酸序列同韓國attenuated DR13疫苗株，英國CV777標準株、CV777 truncated 疫苗株進行同源性分析。ORF3蛋白與CV777標準株相似性為96.45%，與attenuated DR13疫苗株相似性為90.52%，但與CV777 truncated疫苗株相似性僅為79.07%. 運用MEGA 5.0將測得序列與GenBank中檢索的23株相似序列進行系統進化樹分析，這些序列分別是中國的CHQX-02(KF476050)、CH/ZKHFQ/11(JN547394)、CH/T J-2012(KC148525)、CH/HNHJ/08(GU37-2736)、NJ(KJ642645)、GDJM-1205(KC294277)、CH/GSJI/07(GU372737)、FJ/FQ/11(JQ678-038)、CH/JX-2/2013(KJ526096)、JS-HZ2012(KC210147)、SQ/2013(KM890310)、JSBJ2012(KC161189)、ZJ_111128(JX880078)、AHQJ2012(KC161188)，英國標準株CV777(AF353511)、CV777 truncated 疫苗株(GU372744)，韓國毒株DR13(EU054929)、attenuated DR13疫苗株(EU054929)、PFF188(FJ687462)、M2227(HQ537439)、KDGG10KA(KJ857438)，法國分離株Brl/87(Z24733)和美國分離株USA/Illinois201/2014(KR265795)。系統進化樹分析表明，該基因與中國毒株、韓國毒株以及美國分離株USA/ Illinois 201/2014 (KR265795)處于同一進化分支上，而attenuated DR13疫苗株、CV777 truncated疫苗株和歐洲的CV777標準株處于另一個進化分支上，表明該基因與中國毒株、韓國毒株的遺傳距離最近(圖3)。

M.DL-2000 Marker;1.重組菌液PCR產物 PCR product of recombinant bacteria
圖2 PEDV ORF3重組菌液PCR擴增
Fig.2 The amplification of PEDV ORF3 recombinant bacteria

2.3.2 PEDV ORF3蛋白跨膜區 利用TMHMM對PEDV ORF3跨膜區進行預測，結果顯示，ORF3蛋白的第1～37位、95～223位氨基酸位于細胞膜表面，第61～71位氨基酸在細胞膜外，第38～60位、72～94位氨基酸之間各形成一個典型的跨膜螺旋區(圖4)。

圖3 基于PEDV ORF3基因的系統進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of PEDV ORF3 gene

圖4 PEDV ORF3跨膜區分析Fig.4 PEDV ORF3 transmembrane domain analysis

2.3.3 PEDV ORF3的抗原表位預測 利用DNAStar 5.0軟件的Protean程序對PEDV ORF3基因所編碼蛋白質進行二級結構、親水性、抗原指數、表面可及性、柔韌性的預測分析。通過Garnier-Robson法算出特定的氨基酸殘基在特定結構內部的可能性結果為：α-螺旋區域有10個，β-折疊區域有16個，β-轉角區域有7個，無規則卷曲有4個。用Chou-Fasman法預測的結果為：5個α-螺旋區域，9個β-折疊區域，10個β-轉角區域(圖5)。結合2種方法對二級結構預測的結果發現，β-轉角主要集中在第115～157區域。

采用Kyte-Doolittle的方法對ORF3的親水性進行分析，親水性較高的區域(>0)有18～21、41～44、62～68、112～116、135～139、150～154、173～182、213～216和218～222(圖6-A)，但總的來說ORF3蛋白的疏水區域較多，且疏水指數較高。 采用Jameson-Wolf方法分析PEDV ORF3潛在抗原表位位點，以抗原指數>0作為條件，結果表明在第12～24、28～33、40～45、63～71、113～119、132～135、136～144、147～154、173～183和187～194區域的抗原指數較高(圖6-B)。 采用Emini方法對ORF3蛋白表面可及性進行分析，以表面可及性指數>1作為選擇標準，結果顯示，ORF3氨基酸表面可及區域主要有16～20、63～70、113～118、135～138、138～141、174～180、191～193和215～218(圖6-C)。 利用Schulz方法對ORF3的柔韌性進行分析，ORF3骨架區主要有10個柔性區域，分別為第11～21、39～46、62～69、125～128、132～134、139～142、147～151、156～158、172～178和188～141位(圖6-D)。

3 結論與討論

3.1 PEDV ORF3基因同源性比對分析

對PEDV ORF3基因核苷酸序列同源性分析可得，本研究中克隆的ORF3蛋白與CV777標準株相似性為96.45%，與attenuated DR13疫苗株相似性為90.52%，但與CV777 truncated疫苗株相似性僅為79.07%。表明疫苗株與流行株之間存在不同程度的核苷酸差異，可能使動物體在免疫后仍達不到較好的免疫保護效果,甚至導致免疫失敗，這也是目前PEDV在免疫后豬場仍存在流行的原因之一[13]。系統遺傳進化樹分析表明，PEDV ORF3基因在進化上劃分成2個主分支，本研究克隆的 ORF3基因、中國毒株、韓國毒株以及美國毒株USA/ Illinois 201/2014處于同一進化分支上，其中與中國毒株NJ(KJ642645)的遺傳距離最近，且它們之間的相似性最高，為99.41%；而疫苗株和歐洲分離的標準毒株CV777、Brl/87毒株則與分離株的遺傳距離較遠，這與其他研究報道基本一致[14-15]，表明中國近幾年來流行PEDV株發生變異，并可能來自韓國。

A.α-螺旋 α- helical regions ;B.β-折疊 β- folding regions;T.β-轉角 β- Turn regions;C.無規卷曲 Coil region ;S.位置刻度 Scale of locationg;g.Garnier-Robson法 Method of Gamier-Robson; c.Chous-Fasman法 Method of Chou-Fasman
圖5 PEDV ORF3蛋白二級結構
Fig.5 PEDV ORF3 protein secondary structure

圖6 PEDV ORF3蛋白親水性、抗原指數、表面可及性及柔韌性分析Fig.6 Analysis of hydrophilicity plot,antigenic index,surface probability and flexible regions of ORF3 protein in Rongchang

3.2 PEDV ORF3 氨基酸序列比對分析

通過對PEDV ORF3氨基酸序列比對分析得到，該基因與標準毒株CV777相比，除了有部分點突變外，沒有缺失和插入，具有完整的開發閱讀框；然而將attenuated DR13疫苗株、CV777 truncated疫苗株與標準毒株CV777進行比對，發現2個疫苗株均有連續的氨基酸缺失。其中attenuated DRl3疫苗株在第82～98位上缺失17個氨基酸，CV777 truncated疫苗株在第83～97位上缺失15個氨基酸。Park等[16]對PEDV ORF3基因全長分析表明，通過細胞培養致弱的PEDV DR13菌株有17個氨基酸缺失，此缺失未在野生型中得到確定。因此，可推測PEDV ORF3氨基酸的變化可能誘導毒株毒力發生改變，本研究中所克隆的 ORF3基因有可能是來源于PEDV 強毒株。由于PEDV野毒株和細胞培養致弱株 ORF3基因間存在這種連續氨基酸的缺失,可將PEDV在細胞上連續傳代培養并致使 ORF3基因缺失，從而使病毒毒力降低[13,17]。同時，可以根據 ORF3基因的差異來鑒別PEDV野毒株與細胞適應型毒株，也為強弱毒株的鑒別診斷提供依據[16-18]。

3.3 PEDV ORF3 B細胞抗原表位分析

通過對ORF3蛋白的親水性、可及性、柔韌性、抗原指數進行分析可得，該蛋白在第65～68、114～116、137～140和150～154位氨基酸區域具有B細胞抗原表位潛力。抗原表位又稱為抗原決定簇，是抗原分子表面具有特殊結構和免疫活性的化學基團，可刺激機體產生抗體或致敏淋巴細胞。抗原也可通過抗原表位與相應的抗體或致敏淋巴細胞發生特異性結合而引起免疫效應，抗原表位的空間結構、性質和數目對抗原的特異性都會產生影響[19-20]。總的來說，抗原表位是蛋白質抗原性的基礎，也是誘導機體產生特異性免疫應答的基本結構和功能單位。對PEDV ORF3基因編碼的蛋白質的二級結構分析發現，該蛋白質含有較多的α-螺旋、β-折疊及一定量的轉角和無規卷曲，表明該蛋白質結構比較復雜。β-轉角和無規則卷曲為突出結構，多出現在蛋白質抗原表面，結構松散且易發生扭轉，利于結合抗原，因而成為B細胞抗原表位的可能性較大[20-21]。對PEDV ORF3蛋白跨膜區進行預測分析可知，在第38～60、72～94位氨基酸之間形成2個典型的跨膜螺旋區。跨膜區是蛋白質序列中跨越細胞膜的區域，多數為α-螺旋結構，大約由20個強疏水性氨基酸組成[22]。自然狀態下，疏水性氨基酸被包埋在蛋白內部，很難與抗體結合，故通過原核表達技術對ORF3蛋白表達應考慮其跨膜區來篩選抗原表位[21]。也有研究表明，中國豬場中PEDV引致的豬流行性腹瀉已對養豬業健康發展造成巨大威脅，PEDV同其他病原的混合感染往往又加劇了疫情的蔓延，同時疫苗免疫的豬場也爆發PEDV，因此亟需研究PEDV新型疫苗，然而對病毒抗原表位的不斷深入研究，不僅可以全面地了解、掌握抗原結構，而且對疾病的預防、診斷、治療及表位疫苗的構建都起著重要作用[3,23-25]。

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(責任編輯：成 敏 Responsible editor:CHENG Min)

Cloning and Sequence Analysis of Porcine Epidemic Diarrhea Virus ORF3 Gene.

YI Huashan,BI Junxuan,MA Xianping,TANG Minxia,ZHANG Dezhi and WANG Zhiying.

(Department of Veterinary Medicine，Rongchang Campus,Southwest University,Chongqing 402460，China)

To study whether some of pig farms with diarrhea was infected by porcine epidemic diarrhea virus in Rongchang of Chongqing,we cloned and analyzed sequence of the open reading flame 3( ORF3) gene of porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)in this study. The small intestine tissue from piglets suffering from a severe diarrhea was collected. The PEDV ORF3 gene was amplified by using reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) . The results showed that the amplified PEDV ORF3 gene contained 675 bp nucleotides sequence and encoded 223 amino acids. The similarity of the ORF3 gene between the cloned gene and the CV777 standard strain (AF353511) was 96.45%. The highest similarity also showed that it was 99.41% from the China NJ(KJ642645) by DNAMAN software analysis. The ORF3 Gene shared homology at 90.52% with the DR13 vaccine strain(EU054930),while CV777 vaccine strain shared the lowest nucleotide homology at 79.07%. The phylogenetic analysis showed that the cloning gene and China strain,South Korea and the United States USA/ Illinois strains isolated from 201/2014 (KR265795) were in the same evolutionary branch,which they had a close phylogenetic ralationship. While attenuated DR13 and CV777 truncated vaccine strains and the European CV777 standard strain was in another evolutionary branch. The results showed that the amino acid 65-68,114-116,137-140 and 150-154 regions may have potential advantage of epitopes by B cell epitope prediction analysis. We cloned porcine epidemic diarrhea virus ORF3 gene and the studies proved that porcine epidemic diarrhea virus was infected in part of pig farms with diarrhea in Rongchang of Chongqing in 2015.

Porcine epidemic diarrhea virus; ORF3 gene;Sequence analysis

2016-10-13 Returned 2016-12-01

Rongchang Campus Youth Science Foundation of Southwest University (No.RC20700925&RC20700421); Fundamental Research Funds for the Central Universities(No.XDJK2015C032).

YI Huashan,male,lecturer.Research area:veterinary clinical infection and immunity and pathogenic molecular biology. E-mail:lzyhsh@163.com

WANG Zhiying,female,senior experimentalist.Research area:infectious diseases and parasitology of domestic animal. E-mail:wangzhiying402460@163.com

日期：2017-06-29

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170629.1107.012.html

2016-10-13

2016-12-01

西南大學榮昌校區青年科學基金(RC20700925&RC20700421)；中央高校基本業務費專項基金(XDJK2015C032)。

易華山，男，講師，研究方向為獸醫臨床感染與免疫及病原分子生物學。E-mail：lzyhsh@163.com

王芝英，女，高級實驗師，研究方向為家畜傳染病及寄生蟲學。E-mail：wangzhiying402460@163.com

S851.34

A

1004-1389(2017)07-0968-07