高效毛細管電泳法測定大鼠血漿中頭孢地尼濃度及其藥動學研究

劉曉鳳，譚梅英，詹利之(1.廣州醫科大學附屬腫瘤醫院藥學部，廣州 510095;.廣東省第二中醫院/廣東省中醫藥工程技術研究院藥學部，廣州 510095;.廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣州 510405)

高效毛細管電泳法測定大鼠血漿中頭孢地尼濃度及其藥動學研究

劉曉鳳1＊，譚梅英2，詹利之3(1.廣州醫科大學附屬腫瘤醫院藥學部，廣州 510095;2.廣東省第二中醫院/廣東省中醫藥工程技術研究院藥學部，廣州 510095;3.廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣州 510405)

目的:測定大鼠血漿中頭孢地尼濃度，并進行藥動學考察。方法:采用高效毛細管電泳法(HPCE)。使用熔融硅膠毛細管柱(75μm，總長為30 cm，有效長度為21.5 cm)，緩沖液為20mmol/L檸檬酸，進樣電壓為10 kV持續10 s，分離電壓為-20 kV，檢測波長為214 nm。取6只大鼠ig頭孢地尼溶液(20mg/kg)，分別于給藥前及給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、12、24 h經尾緣靜脈取血0.2m L進行測定。采用BAPP 2.0軟件計算藥動學參數。結果:頭孢地尼質量濃度在0.2～50μg/m L范圍內線性關系良好(r=0.999 7)，定量下限為0.2μg/m L;日內(n=6)、日間(n=3)精密度試驗的RSD均不大于12.2%;穩定性試驗的RSD≤9.10% (n=6);方法回收率為95.4%～114.3%(RSD=9.0%，n=6);基質效應為63.5%～70.2%(RSD=10.39%，n=6)。頭孢地尼在大鼠體內的t1/2為(0.54±0.01)h，MRT為(1.90±0.14)h，cmax為(32.92±0.81)μg/m L，tmax為(1.50±0.02)h，AUC0-24h為(46.65±0.44) μg·h/m L，AUC0-∞為(46.83±0.44)μg·h/m L。結論:該方法快速、準確、簡便，可用于大鼠血漿中頭孢地尼濃度的測定及其藥動學考察。

頭孢地尼;高效毛細管電泳法;大鼠;藥動學

作為第三代口服頭孢菌素類抗菌藥物，頭孢地尼主要用于治療對其敏感的葡萄球菌屬、鏈球菌屬、肺炎球菌、消化鏈球菌、丙酸桿菌、淋病奈瑟氏菌、卡他莫拉菌、大腸埃希菌、克雷伯菌屬、奇異變形桿菌、普魯威登斯菌屬、流感嗜血桿菌等菌株所引起的感染[1-3]。其具有抗菌譜廣、抗菌作用強、臨床療效高、毒性低、過敏反應少、方便使用等特點[4]。

目前，通常采用高效液相色譜(HPLC)法進行頭孢地尼的質量控制和藥動學研究。但這些方法普遍存在樣品和溶劑消耗大、分析時間長、色譜柱相對昂貴且易被蛋白和干擾物質堵塞的更換成本高等缺陷[5-7]。Li J等[7]采用柱切換HPLC法測定比格犬體內頭孢地尼的血藥濃度，其中大部分雜質被排除，且整體分析時間較短，但該方法使用的儀器設備需進行改裝，存在儀器設備較為昂貴、穩定性較差等缺點。

高效毛細管電泳技術(HPCE)是在高壓電場作用下，帶電組分隨電場方向遷移的一種分離分析方法[8-10]。由于這種分離在狹小空間內進行(內徑為25～200μm、長度為30～70 cm的毛細管)，加之緩沖液的液流受電場推動而呈平面形，故具有較高的柱效。此外，待測物在該模式下，由于帶電量的不同可導致遷移速率的差異，進而實現分離，且受分子量與極性影響相對較小。因此，在本研究中，筆者采用HPCE法，測定大鼠血漿中頭孢地尼的濃度，并測定其藥動學參數，以期為其進一步應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Beckman P/ACEMDQ毛細管電泳儀，包括光電二極管陣列檢測器(190～600 nm)、P/ACE系統和MDQ工作站軟件(美國Beckman Coulter公司);YN-075365熔融硅膠毛細管(中國河北瑞灃色譜器件有限公司，375 mm×100mm，75μm)。

1.2 藥品與試劑

頭孢地尼膠囊(廣州白云山愛華制藥股份有限公司，批號:204350，規格:每粒0.1 g);頭孢地尼(批號: 1097614，純度:98%)、頭孢哌酮(內標，批號:C0684800，純度:98%)對照品均購自德國Sigma公司;甲醇、檸檬酸、氫氧化鈉等均為色譜純。

1.3 動物

SPF級SD大鼠6只，♀，體質量220～240 g，購自廣東省實驗動物中心[許可證號:SYXK(粵)2015-0059]。

2 方法與結果

2.1 頭孢地尼和內標對照品貯備液的制備

精密稱取頭孢地尼和頭孢哌酮(內標)對照品各10 mg，分別置于10m L量瓶中，加甲醇溶解、定容，即得頭孢地尼和頭孢哌酮質量濃度均為1mg/m L的貯備液。

2.2 血漿樣品處理

精密吸取給藥后大鼠血漿100μL，置1.5m L離心管中，加入1mg/m L頭孢哌酮貯備液10μL，靜置5m in后加300μL乙腈，離心(離心半徑為12.15 cm，13 000 r/m in，下同)10m in。吸取上清液300μL，氮氣吹干，加甲醇100μL復溶，即得。

2.3 HPCE條件

分析柱:熔融硅膠毛細管(375mm×100mm);緩沖液:20mmol/L檸檬酸(含50mmol/L十二烷基硫酸鈉，pH為2.8);檢測波長:214 nm;分離電壓:-20 kV，進樣電壓:10 kV，持續10 s。分析前，用打火機燒去毛細管柱有效長度處的聚亞酰胺涂層以制備檢測窗。毛細管裝入儀器前，先連接蠕動泵，以0.1mmol/L的鹽酸溶液沖洗30min以去除管壁內的雜質;沖水至pH為7.0后，以0.1mmol/L氫氧化鈉溶液沖洗1 h進行活化;再用水沖至流出液體顯中性(pH=7.0)，最后以緩沖液沖洗5 min。之后在儀器上使用緩沖液沖洗30min進行平衡，使用-20 kV電壓平衡直到電流穩定。在此條件下，取空白血漿、給藥1.5 h后血漿+內標、空白血漿+內標依法處理，進樣測定。結果，理論板數以頭孢地尼計不低于3 000，分離度＞1.5，色譜圖見圖1。

圖1 高效毛細管電泳圖Fig 1 HPCE chromatograms

2.4 方法學考察

根據2015年版《中國藥典》(四部)通則9012“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”相關規定進行方法學考察。結果，頭孢替尼質量濃度在0.2～50μg/m L范圍內線性關系良好(r=0.999 7);日內(n=6)、日間(n=3)精密度試驗的RSD均不大于12.2%;方法回收率為95.4%～114.3%(RSD≤13%，n=6);穩定性試驗(血漿于-20℃下冷凍8 h取出解凍，循環3次;25℃放置8 h;處理后置于自動進樣器中8 h)的RSD分別為5.36%、9.10%、8.82%(n=6);基質效應為63.5%～70.2%(RSD= 10.39%，n=6)。此外，采用HPCE法時，還需考察pH、緩沖液濃度和電壓等影響分離分析的參數發生輕微變化時對結果的影響(耐用性試驗)。本研究分別考察pH為4.1、4.5、4.9，緩沖液濃度為18、20、22mmol/L，分離電壓分別為18、20、22 kV情況下頭孢替尼的質量濃度，結果，耐用性試驗的RSD≤4.60%(n=3)，待測物色譜峰與周圍干擾分離度符合要求(≥1.5)。

2.5 分組、造模與給藥

取6只SD大鼠，禁食12 h后ig頭孢地尼溶液(將頭孢地尼膠囊內容物溶于生理鹽水中)，20mg/kg，給藥劑量根據預實驗確定，按人體的等效劑量換算。分別于給藥前及給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、12、24 h經尾緣靜脈取血0.2m L，加肝素后離心10m in，取上清液，-20℃保存。

2.6 藥動學測定

采用BAPP 2.0軟件對大鼠體內藥-時曲線進行非房室模型擬合，并根據所得數據自動計算出相關藥動學參數，結果見圖2、表1。

圖2 頭孢地尼在大鼠體內的藥-時曲線Fig 2 Concentration-timecurveof cefdinir in rats in vivo

表1 頭孢地尼在大鼠體內的藥動學參數(±s，n=6)Tab 1 Pharm acokinetics param eters of cefdinir in rats in viv(o±s，n=6)

表1 頭孢地尼在大鼠體內的藥動學參數(±s，n=6)Tab 1 Pharm acokinetics param eters of cefdinir in rats in viv(o±s，n=6)

參數t1/2，h MRT，h cmax，μg/mL tmax，h AUC0-24h，μg·h/mL AUC0-∞，μg·h/mL頭孢地尼0.54±0.01 1.99±0.14 32.92±0.81 1.50±0.02 46.65±0.44 46.83±0.44

3 討論

3.1 HPCE條件優化

綜合文獻報道和頭孢地尼的理化性質及化學結構[10-13]，筆者選取了分離電壓、pH和緩沖鹽濃度為指標對頭孢地尼和內標與血漿蛋白等干擾性成分電色譜峰的分離度進行了考察。結果顯示，pH對分離度的影響最大，當pH為2.6時，待測組分與干擾性成分的分離度最佳。其原因可能與頭孢地尼的化學結構有關:頭孢地尼的解離常數p K a1=1.9(羧基)，p K a2=3.3(2-氨噻哇環上的氨基)，p K a3=9.9(肟基)。由于熔融硅膠毛細管柱的酸堿承受范圍在pH 2.0～8.0之間，當緩沖液pH低于3.3時，頭孢地尼分子可以得到充分解離，同時毛細管內壁仍可保持穩定。經反復試驗，最終確定緩沖液最佳pH為2.6。分離電壓對HPCE分析也有較為顯著的影響，當電壓較大時，各組分遷移速率較高，但所產生的焦耳熱也較大。綜合考慮柱效、穩定性和整體分離效率，最后選取-20 kV為最優分離電壓。緩沖鹽濃度的影響則主要體現在改變緩沖液pH和離子強度方面，除前述的pH影響外，該參數的變化也可以通過改變電滲流的方向對分離產生影響。經反復試驗，最終確定最優緩沖鹽濃度為20mmol/L。

3.2 血漿樣品前處理方法優化

根據文獻[10-13]報道，本研究對不同提取方法、提取溶劑和溶劑-血漿體積比進行了優化。提取方法分別選取液-液萃取(LLE)和蛋白沉淀(PP)法，前者選用甲基叔丁基醚和乙酸乙酯為提取溶劑，溶劑-血漿比選擇4∶1和6∶1;后者采用甲醇、乙腈和6%高氯酸溶液為蛋白沉淀劑，溶劑-血漿比則選用3∶1和4∶1。筆者在預試驗中以提取回收率和最低定量限為指標，分別考察上述條件下各方法提取目標成分、排除基質干擾的能力。結果顯示，采用蛋白沉淀法，以3∶1比例乙腈為沉淀劑時，頭孢地尼的提取回收率最高。在最低定量限方面，LLE法所制備樣品均不符合規定(信噪比＜10);PP法制備的樣品除6%高氯酸為沉淀劑外，均符合規定。綜上所述，最優血漿樣品前處理方法最終確定為:采用溶劑-血漿比為3∶1的乙腈沉淀蛋白。

3.3 藥動學結果分析

頭孢地尼在動物和人體內的藥動學研究已有文獻報道[5，14-16]。由于本研究采用大鼠作為實驗動物，其藥動學特征與文獻報道中所用的比格犬和人類志愿者有較大差異。在進行換算后，結果顯示t1/2、MRT、cmax、tmax和AUC0-24h等指標均與文獻報道基本吻合，證明本研究可信度較高。

綜上，本研究采用HPCE法對大鼠血樣中的頭孢地尼進行了測定，同時進行了藥動學測定，所用方法快速、靈敏、高效，定量限較低，樣品和溶劑消耗極小，符合體內藥物分析大通量、高靈敏、干擾成分眾多等特點，可作為HPLC法的有效補充。此外，由于HPCE采用電場為驅動力，待測物在微小空間內進行遷移、分離和測定，相較傳統的液相色譜、質譜等方法，更為節約、經濟和環保。

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(編輯:劉明偉)

Determ ination of Cefdinir Concentration in Rat Plasma by High Perform ance Capillary Electrophoresis and Its Pharmacokinetics Research

LIU Xiaofeng1，TAN Meiying2，ZHAN Lizhi3(1.Dept.of Pharmacy，Cancer Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University，Guangzhou 510095，China;2.Dept.of Pharmacy，Guangdong Second TCM Hospital/Guangdong Province Engineering Technology Research Institute of TCM，Guangzhou 510095，China;3.Institute of Tropical Medicine，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510405，China)

OBJECTIVE:To determine the concentration of cefdinir in rat plasma，and investigate its pharmacokinetics.METHODS:High performance capillary electrophoresis(HPCE)was adopted by using fused-silica capillary(75μm，total length of 30 cm，effective length of 21.5 cm)，buffer solution of 20mmol/L citric acid，injection voltage of 10 kV for 10 s，separation voltage of-20 kV，and detection wavelength of 214 nm.6 rats were intragastrically

cefdinir solution(20 mg/kg).0.2 m L blood sample was taken from the tail vein before and 0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6，12，24 h after adm inistration.BAPP 2.0 software was used to calculate the pharmacokinetics parameters.RESULTS:The linear range of cedinir ranged 0.2-50μg/m L(r=0.999 7)，lower limit of quantification was 0.2μg/m L.The intra-day(n=6)and inter-day RSDs of(n=3)precision testwere no more than 12.2%;RSD of stability test was no more than 9.10%(n=6);method recovery rate was 95.4%-114.3%(RSD=9.0%，n=6); matrix effectwas 63.5%-70.2%(RSD=10.39%，n=6).The t1/2of cefdinir in rats in vivo was(0.54±0.01)h，MRT was(1.90± 0.14)h，cmaxwas(32.92±0.81)μg/m L，tmaxwas(1.50±0.02)h，AUC0-24hwas(46.65±0.44)μg·h/m L and AUC0-∞was(46.83± 0.44)μg·h/m L.CONCLUSIONS:Themethod is rapid，accurate and simple，and can be used for the determination of cefdinir concentration in rat plasma and its pharmacokinetics research.

Cefdinir;High performance capillary electrophoresis;Rats;Pharmacokinetics

R917

A

1001-0408(2017)19-2658-04

2017-01-03

2017-05-03)

＊副主任藥師。研究方向:藥物分析。電話:020-66673666-2001。E-mail:liuxiaofengzlyy@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.19