斯皮諾素對(duì)人肝微粒體細(xì)胞色素P450酶的體外抑制作用

張巧月，劉艷艷，萬(wàn)昶宸，廖 曼，張 霞，劉天意，張?zhí)m桐#(.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，石家莊 05007;.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱5008)

斯皮諾素對(duì)人肝微粒體細(xì)胞色素P450酶的體外抑制作用

張巧月1＊，劉艷艷1，萬(wàn)昶宸1，廖 曼1，張 霞1，劉天意2，張?zhí)m桐1#(1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，石家莊 050017;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150081)

目的:研究斯皮諾素對(duì)人肝微粒體細(xì)胞色素P450(CYP450)酶7種亞型(CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP1A1、CYP2C19和CYP3A4)的體外抑制作用。方法:以200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39μmol/L的斯皮諾素與人肝微粒體共同孵育，分別以他克寧、安非他酮、鹽酸阿莫地喹、雙氯芬酸鈉、美芬妥英、氫溴酸右美沙芬和咪達(dá)唑侖作為上述7種亞型CYP450酶的特異性探針?biāo)幬?。采用超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定7種探針?biāo)幬锏拇x產(chǎn)物生成量，計(jì)算斯皮諾素對(duì)人肝微粒體中7種亞型CYP450酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)。結(jié)果:斯皮諾素對(duì)人肝微粒體7種亞型CYP450酶的IC50分別為1 714、1 158、226.1、2 288、80.59、101.1、1 119μmol/L，均大于50μmol/L。結(jié)論:斯皮諾素對(duì)人肝微粒體CYP450酶的上述7種亞型均無(wú)抑制作用，引發(fā)藥物代謝性相互作用的可能性較小。

斯皮諾素;超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法;細(xì)胞色素P450酶;抑制作用

酸棗仁(Semen Zizyphi Spinosae，SZS)是鼠李科(Phamnaceae)植物酸棗[Zizyphus jujuba Mill.var spinosa (Bunge)Hu ex H.F.Chou]的干燥成熟種子[1]，是治療失眠和焦慮的經(jīng)典中藥之一，其化學(xué)成分包括達(dá)瑪烷型三萜皂苷、黃酮類(lèi)化合物、生物堿、三萜類(lèi)化合物、維生素和多糖等[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，酸棗仁黃酮能顯著延長(zhǎng)巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠的時(shí)間[3]。斯皮諾素為酸棗仁黃酮的主要活性物質(zhì)，是酸棗仁湯鎮(zhèn)靜催眠的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一[4]，能通過(guò)5-羥色胺(5-HT)系統(tǒng)延長(zhǎng)戊巴比妥誘導(dǎo)大鼠睡眠的時(shí)間[5]。所以，深入研究斯皮諾素對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用酸棗仁具有一定意義。

代謝性相互作用主要是由于藥物對(duì)代謝酶產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用所致，起主導(dǎo)作用的是細(xì)胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP450)[6]。肝CYP450酶系是一類(lèi)含鐵的血紅素蛋白超家族，負(fù)責(zé)大量外源性化合物的氧化代謝，同時(shí)對(duì)部分內(nèi)源性化合物的代謝也起著重要作用，在人體內(nèi)易被聯(lián)合應(yīng)用的藥物誘導(dǎo)和抑制，從而導(dǎo)致藥物濃度發(fā)生巨大變化，產(chǎn)生增效或毒副作用[7-8]。人體內(nèi)CYP450酶是由多種同工酶組成的大家族，其中CYP1A1、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4與藥物代謝密切相關(guān)。研究藥物對(duì)CYP450酶作用的方法主要包括體內(nèi)代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)以及體外亞細(xì)胞或細(xì)胞試驗(yàn)[9]。本文采用美國(guó)FDA推薦的特異性探針?biāo)幬镅芯克蛊ぶZ素對(duì)人肝微粒體中7種亞型CYP450酶的影響，通過(guò)評(píng)估斯皮諾素在體外代謝體系中對(duì)CYP450酶特異性探針底物的抑制程度，預(yù)測(cè)其在體內(nèi)可能引發(fā)的藥物代謝性相互作用，為其臨床安全用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AB SCIEX Triple-TOF 5600+三重四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，包括Duospray離子源、Analyst Software1.7數(shù)據(jù)采集分析軟件(美國(guó)AB公司);LC-30A超高效液相色譜儀，包括CTO-30A柱溫箱、CBM-20A系統(tǒng)控制器和SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器(日本島津公司);D3024R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Scilogex公司)。

1.2 藥品與試劑

斯皮諾素對(duì)照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào):121220，純度:＞98%);磺胺甲噁哇、安非他酮、鹽酸阿莫地喹、雙氯芬酸鈉、氫溴酸右美沙芬對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):100025-3200904、100671-200301、101217-201401、100334-200302、100201-201204，純度:＞98%);他克寧對(duì)照品(加拿大Trc公司，批號(hào): A629700，純度:＞98%);美芬妥英對(duì)照品(北京百靈威科技有限公司，批號(hào):303768，純度:＞98%);咪達(dá)哇侖注射液(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):20150208，規(guī)格:2m L∶10mg);還原型輔酶Ⅱ(NADPH，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào):524F016，純度:＞98%);50人合1混合人源肝微粒體、氯化鎂(美國(guó)BD Bioscience公司，批號(hào):H0610、20140730);水為純凈水，甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 斯皮諾素對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取斯皮諾素對(duì)照品適量，用甲醇溶解制成40mmol/L的貯備液;精密量取貯備液適量，用甲醇依次稀釋成系列濃度對(duì)照品溶液。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱(chēng)取磺胺甲噁哇對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋成170 ng/m L的溶液。

2.1.3 探針?biāo)幬锶芤?分別精密稱(chēng)取安非他酮(CYP2B6探針)、鹽酸阿莫地喹(CYP2C8探針)、雙氯芬酸鈉(CYP2C9探針)、氫溴酸右美沙芬(CYP2D6探針)、他克寧(CYP1A1探針)、美芬妥英(CYP2C19探針)和咪達(dá)哇侖(CYP3A4探針)對(duì)照品適量[10]，分別用甲醇溶解制成5、1、1、1、5、30、1mmol/L的溶液。

2.1.4 氯化鎂溶液 精密稱(chēng)取氯化鎂適量，用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解制成16mmol/L的溶液。

2.2 人肝微粒體溫孵反應(yīng)

試驗(yàn)分為人肝微粒體溫孵體系組[含人肝微粒體、探針?biāo)幬锖拖盗袧舛鹊乃蛊ぶZ素對(duì)照品溶液的PBS (pH 7.2～7.4)]和空白組(等量甲醇)。各組先37℃預(yù)熱孵化振蕩10 m in，再加入預(yù)熱的NADPH啟動(dòng)反應(yīng)[11-12]。NADPH、氯化鎂的終濃度分別為2、4mmol/L;系列濃度的斯皮諾素對(duì)照品溶液在孵育體系中的終濃度分別為200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39μmol/L，溫孵體系的體積為200μL，有機(jī)溶劑體積低于總溫孵體系體積的1%，每個(gè)溫孵體系平行制備3份。溫孵體系于37℃恒溫振蕩反應(yīng)一段時(shí)間后取出，立即加入含內(nèi)標(biāo)的冰甲醇200μL終止反應(yīng)。7種亞型CYP450酶對(duì)應(yīng)的探針?biāo)幬锏臐舛?、人肝微粒體質(zhì)量濃度和溫孵時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 7種亞型CYP450酶對(duì)應(yīng)的探針?biāo)幬锏臐舛取⑷烁挝⒘ｓw質(zhì)量濃度和溫孵時(shí)間Tab 1 Probe substrate concentration，mass concentration of human liverm icrosomes and incubation timeof7 subtypesof CYP450enzymes

2.3 樣品處理

將終止反應(yīng)的樣品渦旋2m in，14 000×g離心10 m in，取上清液用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾。取續(xù)濾液進(jìn)樣分析，測(cè)定7種探針?biāo)幬锏拇x產(chǎn)物生成量。

2.4 代謝產(chǎn)物的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件色譜柱:Poroshell120 ECC18(50mm× 2.1mm，2.7μm);流動(dòng)相:0.05%甲酸水溶液(A)-0.05%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脫(0～3m in，15%B～50%B; 3～5 min，50%B～95%B;5～5.5 min，95%B;5.5～6 m in，95%B～15%B;6～7.5 m in，15%B);流速:400 μL/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:5μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI源)，TurboV離子源，正離子模式，源噴射電壓:5 500 V;霧化溫度: 550℃，霧化氣(GS1，N2)壓力:55 psi，輔助氣(GS2，N2)壓力:55 psi，氣簾氣(N2)壓力:30 psi。

2.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理軟件為MultiQuant3.0。溫孵體系中探針?biāo)幬锎x產(chǎn)物的生成量代表酶的活性。以(峰面積樣品組代謝產(chǎn)物/峰面積內(nèi)標(biāo))/(峰面積空白組代謝產(chǎn)物/峰面積內(nèi)標(biāo))計(jì)算酶的相對(duì)活性(%)。以相對(duì)活性為縱坐標(biāo)、抑制劑(斯皮諾素)濃度的對(duì)數(shù)值(lg c)為橫坐標(biāo)，應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行非線性擬合，計(jì)算斯皮諾素對(duì)7種亞型CYP450酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)。斯皮諾素對(duì)7種亞型CYP450酶的抑制曲線見(jiàn)圖1。

結(jié)果顯示，斯皮諾素對(duì)CYP1A1、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的IC50分別為1 714、1 158、226.1、2 288、80.59、101.1、1 119 μmol/L，遠(yuǎn)大于50μmol/L。這說(shuō)明斯皮諾素對(duì)這7種亞型CYP450酶沒(méi)有抑制作用，其由于代謝性相互作用而引發(fā)不良反應(yīng)的可能性很小;在臨床應(yīng)用時(shí)，不易引發(fā)代謝性藥物相互作用。

圖1 斯皮諾素對(duì)CYP450酶7種亞型的抑制曲線Fig 1 Inhibition curves of spinosin on 7 subtypes of CYP450enzymes

3 討論

內(nèi)標(biāo)物的選擇應(yīng)符合化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、與被測(cè)物質(zhì)性質(zhì)相近、不與樣品中的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)且保留時(shí)間與被測(cè)物質(zhì)相近的要求。預(yù)試驗(yàn)中筆者比較了磺胺甲噁哇和鹽酸苯海拉明，發(fā)現(xiàn)磺胺甲噁哇在正離子模式下峰形較好，故選定磺胺甲噁哇為本試驗(yàn)內(nèi)標(biāo)物。

參與肝臟藥物代謝的CYP450酶有CYP1、CYP2、CYP3及CYP4四個(gè)家族。酶抑制作用所致的藥物相互作用的臨床意義遠(yuǎn)大于酶誘導(dǎo)作用，酶抑制作用約占代謝性相互作用的70%[6]。根據(jù)美國(guó)FDA推薦，本試驗(yàn)選擇了7種特異性探針?biāo)幬锇卜撬?、鹽酸阿莫地喹、雙氯芬酸鈉、氫溴酸右美沙芬、他克寧、美芬妥英和咪達(dá)哇侖來(lái)評(píng)價(jià)斯皮諾素對(duì)7種亞型CYP450酶的抑制作用，其生成的代謝產(chǎn)物分別為羥基安非他酮、N-脫乙基阿莫地喹、4′-羥基雙氯芬酸、O-脫甲基右美沙芬、1-羥基他克寧、4′-羥基美芬妥英和1-羥基咪達(dá)哇侖。

IC50表示藥物在產(chǎn)生50%抑制作用時(shí)的藥物濃度。該值越小，代表藥物的抑制作用越強(qiáng)[6]?；衔飳?duì)CYP450酶的抑制程度可按IC50分為如下等級(jí):強(qiáng)抑制劑(IC50≤1μmol/L)，中等抑制劑(1μmol/L＜IC50≤10μmol/L)，弱抑制劑(10μmol/L＜IC50≤50μmol/L);當(dāng)IC50大于50 μmol/L時(shí)，化合物則被認(rèn)為沒(méi)有抑制作用[13]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，斯皮諾素對(duì)人肝微粒體CYP450酶的7種亞型CYP1A1、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4均無(wú)抑制作用，引發(fā)藥物代謝性相互作用的可能性較小。該結(jié)果為斯皮諾素的進(jìn)一步臨床研究和聯(lián)合用藥提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部[S].2015年版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015:366-367.

[2]馬進(jìn)杰，劉萍，馬百平.酸棗仁化學(xué)成分及其鎮(zhèn)靜催眠作用研究進(jìn)展[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2011，38(3):206-211.

[3]Jiang JG，Huang XJ，Chen J，etal.Comparison of the sedativeand hypnotic effects of flavonoids，saponins and polysaccha-rides extracted from Semen Zizyphus jujube [J].NatProd Res，2007，21(4):310-320.

[4]LiYJ，Bi KS.Study on the therapeuticmaterial basis of traditional Chinesemedicinal preparation Suanzaoren decoction[J].Chem Pharm Bull，2006，54(6):847-851.

[5]Wang LE，BaiYJ，Shi XR，et al.Spinosin，a C-glycoside flavonoid from Semen Zizyphi Spinosae，potentiated pentobarbital-induced sleep via the serotonergic system [J].Pharmacol Biochem Behav，2008，90(3):399-403.

[6]劉潔.“Cocktail”探針?biāo)幬锓ㄔu(píng)價(jià)丹參酮ⅡA對(duì)大鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450不同亞型體外代謝活性的影響[D].天津:天津醫(yī)科大學(xué)，2012.

[7]李丹，韓永龍，余奇，等.不同功效中藥對(duì)細(xì)胞色素P450影響的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2011，22(7):656-658.

[8]許愛(ài)霞，賈海，袁繼勇，等.振源膠囊對(duì)細(xì)胞色素P450酶CYP1A2、CTP3A4、CYP2E1的影響[J].中國(guó)藥房，2010，21(35):3290-3292.

[9]楊本坤，王素軍，莫李立，等.藥物代謝體外模型的研究進(jìn)展[J].廣東藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27(6):649-652.

[10]Yuan L，Jia PP，Sun YP，etal.Study of in vitrometabolism ofm-nisoldipine in human livermicrosomes and recombinant cytochrome P450enzymes by liquid chromatography-mass spectrometry[J].JPharm Biomed Anal，2014，97(97):65-71.

[11]陳建龍，張玉玲，董宇，等.Cocktail探針?biāo)幬锓ㄔu(píng)價(jià)小檗堿對(duì)肝微粒體CYP450酶的抑制作用[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38(12):2009-2014.

[12]徐文，王澤霞，劉濤，等.丹參中11個(gè)活性成分對(duì)人肝微粒體細(xì)胞色素酶活性的作用研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2015，50(7):619-622.

[13]李海云.常用中藥成分對(duì)藥物代謝酶CYP3A4活性的影響[D].上海:第二軍醫(yī)大學(xué)，2009.

(編輯:鄒麗娟)

Inhibition Effect of Spinosin on Cytochrome P450Enzymes from Human Liver M icrosomes in vitro

ZHANG Qiaoyue1，LIU Yanyan1，WAN Changchen1，LIAO Man1，ZHANG Xia1，LIU Tianyi2，ZHANG Lantong1(1.Teaching and Research Section of Pharmaceutical Analysis，School of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China;2.School of Pharmacy，Harbin Medical University，Harbin 150081，China)

OBJECTIVE:To study the inhibition effect of spinosin on 7 subtypes(CYP2B6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2D6，CYP1A1，CYP2C19 and CYP3A4)of cytochrome P450(CYP450)enzymes from human liverm icrosomes in vitro.METHODS:Taking 200.00，100.00，50.00，25.00，12.50，6.25，3.13，1.56，0.78，0.39μmol/L spinosin and human livermicrosomes for incubation，using daktarin，bupropion，amodiaquine hydrochloride，diclofenac sodium，mephenytoin，dextromethorphan hydrobrom ide and m idazolam as the specific probe drugs for above-mentioned 7 subtypes of CYP450enzymes.UPLC-Q-TOF-MSwas conducted to detect generation amount of 7 probe drug metabolites，and the half inhibitory concentration(IC50)of spinosin on 7 subtypes of CYP450enzymes from human liverm icrosomes was calculated.RESULTS:IC50of spinosin on 7 subtypes of CYP450enzymes from human livermicrosomeswere 1 714，1 158，226.1，2 288，80.59，101.1，1 119μmol/L，respectively，which were higher than 50 μmol/L.CONCLUSIONS:Spinosin has no inhibition effect on above-mentioned 7 subtypes of CYP450enzymes from human liver m icrosomes，w ith very low probability of inducingmetabolic drug interactions.

Spinosin;UPLC-Q-TOF-MS;Cytochrome P450enzymes;Inhibition effect

R361+.3

A

1001-0408(2017)19-2645-03

2016-10-26

2016-12-15)

＊碩士研究生。研究方向:藥物分析與質(zhì)量控制。電話:0311-86266419。E-mail:694910334@qq.com

#通信作者:教授，博士生導(dǎo)師，博士。研究方向:藥物質(zhì)量控制、藥動(dòng)學(xué)。電話:0311-86266419。E-mail:zhanglantong@263.net

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.15