高良姜素的體外透皮吸收特性研究Δ

霍仕霞，高 莉，彭曉明，溫季軒，閆 明(1.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所，烏魯木齊 830049;2.新疆維吾爾醫方劑學實驗室，烏魯木齊 830049)

高良姜素的體外透皮吸收特性研究Δ

霍仕霞＊，高 莉，彭曉明，溫季軒，閆 明#(1.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所，烏魯木齊 830049;2.新疆維吾爾醫方劑學實驗室，烏魯木齊 830049)

目的:考察高良姜素的體外透皮吸收特性及不同促透劑對其透皮行為的影響，為開發以高良姜素為原料藥的治療白癜風的皮膚給藥制劑提供參考。方法:采用高效液相色譜法測定高良姜素的含量。以高良姜素的累積透過量(Q)和透皮速率(J)為指標，考察接收液[20%、40%聚乙二醇400(PEG400)溶液和30%乙醇溶液]、轉速(200、300、400 r/min)對高良姜素在小鼠完整皮膚中吸收的影響，考察氮酮(1%、3%、5%)、丙二醇(10%、20%、40%)單用或者聯用對其促透作用。同時，考察高良姜素在大鼠和小鼠的完整皮膚、去角質層皮膚、真皮層皮膚的透過特性。結果:以接收液為40%PEG400溶液、轉速為300 r/m in、5%氮酮單用時，高良姜素在小鼠完整皮膚中的透過性最好，J為3.257 0μg/(cm2·h)。小鼠完整皮膚、去角質層皮膚、真皮層皮膚的J分別為2.719 9、34.016、33.874μg/(cm2·h)，大鼠3種皮膚的J分別為0.499 6、9.512 4、17.406μg/(cm2·h)。結論:高良姜素可以透過小鼠和大鼠的完整皮膚，但是透過量遠低于去角質層皮膚和真皮層皮膚。

高良姜素;透皮吸收;促透劑;完整皮膚;去角質層皮膚;真皮層皮膚

高良姜素(化學名為3，5，7-三羥基黃酮)是一種天然的黃酮醇類化合物，是姜科植物高良姜(Alpiniaofficinarum Hance.)的干燥根莖中的主要有效成分。本課題組前期研究發現，高良姜有效部位具有治療白癜風的功效[1];并進一步通過分離、純化及合成等方法得到了高良姜素單體成分，并證實了其可促進人黑色素瘤細胞增殖、提高酪氨酸酶活性[2-3]、對實驗性C57BL/6白癜風小鼠具有改善作用[4-5]，提示該化合物有望進一步開發成為治療白癜風的新藥。而目前關于白癜風的治療藥物大多是口服藥，在臨床用藥過程中由于存在首關效應強、半衰期短等因素，大大影響了藥物的療效。經皮給藥系統相對于口服制劑在患者用藥依從性上有明顯的優勢。因此，筆者考察了高良姜素在離體大鼠和小鼠皮膚中的透皮吸收特性，為后期開發以高良姜素為原料藥的治療白癜風的皮膚給藥制劑提供研究基礎。

1 材料

1.1 儀器

TP-3A智能藥物透皮擴散試驗儀(上海興創科學儀器設備有限公司);BS244S電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司];高效液相色譜(HPLC)儀(包括LC-20AB泵、SPD-M 20A二極管陣列檢測器、CBM-20A系統控制器、CT0-20A柱溫箱、SIL-20A自動進樣器、DGU-20A3在線脫氣裝置和VP-ODS色譜柱)購自日本島津公司。

1.2 試劑

高良姜素原料藥(上海永恒生物有限公司，批號: 20110921，純度:≥99.9%);高良姜素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:121263-200502，純度:99.9%);甲醇(色譜純，德國默克集團);磷酸(分析純，天津市登科化學試劑有限公司);甲醇、乙醇(分析純，天津市富宇精細化工有限公司);聚乙二醇400(PEG400，天津市盛奧化學試劑有限公司);1，2-丙二醇(天津市北聯精細化學品開發有限公司);氮酮(天津市福晨化學試劑廠)。

1.3 動物

SD大鼠(♂，體質量180～220 g)和KM小鼠(♂，體質量18～22 g)均由新疆醫科大學動物中心提供，實驗動物生產許可證號:SCXK(新)2011-0004。

2 方法與結果

2.1 離體動物皮膚的制備

2.1.1 完整動物皮膚的制備 將SD大鼠、KM小鼠拉頸處死，俯臥置于手術板上，固定四肢，用眼科剪緊貼毛根剪除背部鼠毛，剝取皮膚，小心剔除皮下組織和脂肪，生理鹽水反復沖洗干凈，置于鋁箔紙內，即得。將皮膚置于-40℃低溫冰箱中保存，備用。試驗時取出，室溫下自然解凍后使用，保存時間不超過2周[6]。

2.1.2 去角質層皮膚的制備 將Wing TaiTape膠帶完全黏附于去毛動物皮膚表面后撕下，如此反復操作50～60次，直至皮膚表面光潔[7]，即得。將皮膚置于-40℃低溫冰箱中保存，備用。

2.1.3 真皮層皮膚的制備 將完整的動物皮膚浸于60℃水中，30 s后取出，用手術刀刮去表皮層[7]，即得。將皮膚置于-40℃低溫冰箱中保存，備用。

2.2 色譜條件及方法學考察

2.2.1 色譜條件色譜柱:VP-ODS(250mm×4.6mm，5 μm);流動相:甲醇-0.2%磷酸水溶液(62∶38，V/V);檢測波長:266 nm;流速:1.0m L/m in;柱溫:30℃;進樣量:10 μL。

2.2.2 標準曲線的繪制 精密稱取高良姜素對照品2.01mg至10m L量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，然后取1m L溶液于10m L量瓶中制成201μg/m L的對照品貯備液。分別精密吸取上述貯備液0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8m L至10m L量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制備成質量濃度為0.251 2、0.502 5、1.005、2.010、4.020、8.040、16.08μg/m L的系列對照品溶液。按“2.2.1”項下色譜條件進樣，以高良姜素對照品質量濃度為橫坐標(x，μg/m L)、峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線，得回歸方程為y=50 041x-11 548(r=0.999 6)，表明高良姜素在0.251 2～16.08μg/m L范圍內線性關系良好。

2.2.3 專屬性 分別將空白溶液(甲醇溶液)、高良姜素對照品溶液(2.010μg/m L)及高良姜素原料藥溶液(精密稱取高良姜素原料藥20.2mg至20m L量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度;再精密吸取上述溶液0.1m L至10m L量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制得2.020μg/m L的高良姜素原料藥溶液)進樣分析。結果高良姜素對照品和高良姜素原料藥在相同位置(保留時間為27.68m in)出現色譜峰，而空白溶液在相同位置無色譜峰，表明試驗專屬性較好。

2.2.4 精密度 取“2.2.2”項下0.251 2、4.020、16.08 μg/m L的對照品溶液，于同日內分別連續進樣測定6次，得高良姜素峰面積的RSD分別為1.73%、1.21%、0.66% (n=6)，表明試驗精密度良好。

2.2.5 檢測限和定量限 取“2.2.2”項下0.251 2μg/m L的對照品溶液為母液，逐級稀釋后進樣測定。當信噪比為3時，對應的高良姜素質量濃度為0.105 ng/m L，即為檢測限;當信噪比為10時，對應的高良姜素質量濃度為0.502 5 ng/m L，即為定量限。

2.2.6 準確度 精密吸取已知濃度的高良姜素透皮接收液0.1m L，平行操作6份，分別加入質量濃度為16.08 μg/m L的高良姜素對照品溶液1m L，甲醇稀釋定容至10m L量瓶中，進樣分析，計算方法回收率。結果平均方法回收率為99.53%，RSD為0.91%(n=6)，表明方法準確度較好。

2.3 體外透皮試驗

2.3.1 試驗方法 將動物完整皮膚、去角質層皮膚和真皮層皮膚置于預先放有攪拌子的水平擴散池的結合部，角質層皮膚面向供給池，真皮層皮膚面向接收池，夾緊密封。供給池內定量加入已知質量濃度的高良姜素原料藥溶液及透皮促進劑水溶液，接收池內裝入接收液，兩池連接水浴裝置以維持整個系統溫度在37℃。分別在設定時間從接收池內取樣1m L，并同時補入1m L的蒸餾水或其他接收液，將樣品液以0.45μm濾膜過濾后進樣分析，計算高良姜素的累積透過量(Q，μg/cm2)和透皮速率[J，μg/(cm2·h)]，公式如下[7-8]:

V為接收池體積，A為皮膚有效擴散面積，ci為第i (i≤n-1)個取樣點藥物濃度的測定值。以Q對t進行回歸，得到回歸方程:Q=Jt+b。式中，J為滲透速率，t為取樣時間，b為回歸直線截距。

2.3.2 接收液的選擇 精密稱取高良姜素原料藥9份，每份0.02 g，分別溶于30%乙醇溶液中(預試驗結果顯示高良姜素在10%的乙醇中不易溶解，故直接采用30%乙醇溶液)，作為供給液，每3份為一組。透過皮膚選擇KM小鼠的完整皮膚，按“2.3.1”項下方法操作，接收液分別為20%、40%PEG400溶液和30%乙醇溶液，設置轉速均為200 r/min，維持體系溫度在37℃。24 h后取接收液進樣分析，測定高良姜素含量。結果表明，當接收液為40%PEG400水溶液時接收液中高良姜素含量最高，故以40%PEG400水溶液作為本研究接收液。

2.3.3 轉速的選擇 精密稱取高良姜素原料藥9份，每份0.02 g，分別溶于30%的乙醇溶液中，每份5m L，作為供給液，每3份為一組。接收液為40%PEG400溶液，透過皮膚選用KM小鼠完整皮膚，安裝擴散裝置，設定系統溫度為37℃，3組樣品溶液分別設定轉速為200、300、400 r/m in，均于第2、4、6、8 h時取樣1m L，按“2.3.1”項下方法操作并計算高良姜素的Q和J。結果表明，Q和J的值并不隨轉速的加快而升高，當轉速為300 r/min時Q、J值均最大，故以300 r/m in作為本研究的轉速，結果詳見表1。

2.4 促透劑對高良姜素透皮特性的影響

表1 轉速對高良姜素在小鼠完整皮膚中透皮行為的影響Tab 1 Effect of rotating speed on transdermal behaviorsofgalangin in com p lete skin ofm ice

2.4.1 氮酮 精密稱取高良姜素原料藥0.02 g分別溶于含1%、3%、5%氮酮的30%乙醇溶液中，均平行制備3份，每份5m L，作為供給液。以40%PEG400溶液為接收液，透過皮膚選用KM小鼠完整皮膚，安裝擴散裝置，設置系統溫度為37℃、轉速為300 r/m in。分別于2、4、6、8 h時取樣1m L，并補充1m L接收液，樣品液過0.45 μm濾膜后進樣測定并計算高良姜素的Q、J值;同時不加高良姜素原料藥，按照以上操作進行空白試驗。結果顯示，以含5%氮酮的30%乙醇溶液制備供給液時高良姜素Q、J值均最高，結果見表2。

表2 不同比例的氮酮對高良姜素在小鼠完整皮膚中透皮行為的影響Tab 2 Effect of different proportions of azone on transdermalbehaviors of galangin in com p lete skin ofm ice

2.4.2 丙二醇 精密稱取高良姜素原料藥0.02 g，分別溶于含10%、20%、40%丙二醇的30%乙醇溶液中，均平行制備3份，每份5m L，作為供給液。按“2.4.1”項下方法操作，計算高良姜素的Q、J值。結果顯示，以含10%丙二醇的30%乙醇溶液制備供給液時高良姜素的Q、J值均最高，結果見表3。

表3 不同比例的丙二醇對高良姜素在小鼠完整皮膚中透皮行為的影響Tab 3 Effect of different proportionsof propylene glycols on transderm al behaviors of galangin in com p lete skin ofm ice

2.4.3 5%氮酮與10%丙二醇聯合使用 精密稱取高良姜素原料藥0.02 g，溶于含5%氮酮和10%丙二醇的30%乙醇溶液中，作為供給液，平行制備9份，每份5m L。按“2.4.1”項下方法操作，計算高良姜素的Q、J值。結果第2、4、6、8 h的Q值分別為1.492、5.287、6.593、8.552μg/cm2，Q-t方程為Q=2.248 4t-0.14，J為2.248 4 μg/(cm2·h)，可見5%氮酮與10%丙二醇聯合使用的促透皮效果不如兩者單用好。

2.5 高良姜素在動物不同皮膚層的透過特性

2.5.1 在小鼠不同皮膚層的透過特性 精密稱取高良姜素原料藥0.02 g，溶于30%乙醇溶液中，平行制備9份，每份5m L，作為供給液。接收液為40%PEG400溶液，透過皮膚選用KM小鼠完整皮膚、去角質層皮膚和真皮層皮膚，均平行3份。安裝擴散裝置，設定溫度為37℃、轉速為300 r/m in。于第2、4、6、8 h時取樣1m L，并補充1m L接收液，樣品液過0.45μm濾膜，進樣測定含量，計算Q、J值。結果顯示，小鼠去角質層皮膚和真皮層皮膚的Q8h、J值基本無差異，且均比完整皮膚的透過性好，結果見表4。

表4 高良姜素在小鼠不同皮膚層的透過特性測定結果Tab 4 Determ ination results of transderm al p ropertiesofgalangin in different skin layersofm ice

2.5.2 在大鼠不同皮膚層的透過特性 精密稱取高良姜素原料藥0.02 g，溶于30%乙醇溶液中，平行制備9份，每份5m L，作為供給液。接收液為40%PEG400溶液，透過皮膚選用SD大鼠完整皮膚、去角質層皮膚和真皮層皮膚，均平行3份。安裝擴散裝置，按“2.5.1”項下方法進樣測定。結果顯示，高良姜素在大鼠的各層皮膚的透過速率從大到小為真皮層＞去角質層＞完整皮膚，且在去角質層皮膚和真皮層皮膚的J遠遠高于完整皮膚，結果見表5。

表5 高良姜素在大鼠不同皮膚層的透過特性測定結果Tab 5 Determ ination results of transderm al p ropertiesofgalangin in different skin layersof rats

3 討論

本研究的對象高良姜素為脂溶性化合物，微溶于水，易溶于乙醇溶液中，筆者根據預試驗結果選擇30%乙醇溶液制備供給液，進行相關參數的考察及透皮特性研究。在進行接收液選擇時考察了20%、40%PEG400溶液以及30%乙醇溶液，結果以40%PEG400溶液為接收液時高良姜素含量最高，以30%乙醇溶液為接收液時含量最少。這可能是在透皮滲透過程中部分乙醇揮發而造成高良姜素溶解性降低、接收量小。而PEG400作為一種增溶劑，能夠大大提高高良姜素的溶解性，20% PEG400溶液沒有40%PEG400溶液增溶效果好，故選擇40%PEG400溶液作為接收液。轉速考察結果表明，并不是轉速越高高良姜素J值越高，轉速為300 r/min時，J值最高。

氮酮和丙二醇是常用的透皮促進劑。氮酮具有促吸收作用，氮酮分子滲入皮膚角質層，通過與角質層脂質相互作用，破壞了角質層的有序結構，導致其結構松散、流動性增加，使藥物易于轉運。而丙二醇具有促溶解作用，是一種通過增強藥物在角質層中分配的透皮促進劑[9]。本研究結果顯示，在高良姜素供給液中加入適量氮酮和丙二醇后，高良姜素的Q、J值均顯著增加，且隨著氮酮濃度的增加Q、J值增加;然而，隨著丙二醇的濃度增加Q、J反而降低。其中，5%氮酮、10%丙二醇促吸收作用較好，然而將二者聯合使用時，促透皮效果均沒有單獨使用時好。

小鼠不同皮膚層的透過試驗顯示，去角質層皮膚的J為34.016μg/(cm2·h)，真皮層皮膚的J為33.874μg/(cm2·h)，遠遠大于完整皮膚;大鼠不同皮膚層的透過試驗顯示，去角質層皮膚的J為9.512 4μg/(cm2·h)，真皮層皮膚的J為17.406μg/(cm2·h)，高良姜素在大鼠真皮層的透過性要優于去角質層。可見，角質層是阻礙高良姜素透過皮膚的主要屏障，該結果為今后開發以高良姜素為原料藥的透皮給藥制劑提供了參考依據。

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Study on the in vitro Transdermal Absorption Properties of Galangin

HUO Shixia，GAO Li，PENG Xiaom ing，WEN Jixuan，YAN M ing(1.Xinjiang Institute of Traditional Uygur Medicine，Urmuqi830049，China;2.Xinjiang Laboratory of Uygur Medical Prescription，Urmuqi830049，China)

OBJECTIVE:To investigate the in vitro transdermal absorption properties of galangin and effects of different penetration enhancers on its transdermal behaviors，and provide reference for developing skin preparations using galangin as APIs in the treatment of vitiligo.METHODS:HPLC was used to determine the galangin content.Using cumulative permeation rate(Q)and the transdermal rate(J)of galangin as indexes，the effect of absorption of receiving solution[20%，40%polyethylene glycol 400 (PEG400)solution and 30%ethanol solution]and rotating rate(200，300，400 r/m in)on galangin in complete skin ofmice were investigated，aswell as the azone(1%，3%，5%)and propylene glycol(10%，20%，40%)alone or combination on its penetration promotion.And the transdermal properties of galangin in complete skin，exfoliating skin，dermis skin of rats and micewere detected.RESULTS:The best permeability of complete skin of m ice showed in 40%PEG400 solution at rotating speed of 300 r/m in

with 5%azone alone，J was 3.257 0μg/(cm2·h).J s of complete skin，exfoliating skin，dermis skin ofmice were 2.719 9，34.016，33.874μg/(cm2·h)，respectively;and those of rats were 0.499 6，9.512 4，17.406μg/(cm2·h).CONCLUSIONS:Galangin can penetrate the complete skin ofmice and rats，however，the penetration quantity is far lower than exfoliating skin and dermis skin.

Galangin;Transdermal absorption;Transdermal enhancer;Complete skin;Exfoliating skin;Derm is skin

R285

A

1001-0408(2017)19-2631-04

2016-11-13

2017-02-08)

(編輯:林 靜)

新疆地產中藥民族藥新藥研發培育項目(No. Q2015-02-3);新疆維吾爾自治區科技人才培養項目(No.qn2015yx042)

＊副研究員，碩士。研究方向:藥物分析、中藥藥動學。電話: 0991-6642410。E-mail:huoshixia1983@163.com

#通信作者:研究員，碩士。研究方向:藥物分析、新藥研發。電話:0991-2574309。E-mail:yanming21cn@sohu.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.11