扶正解毒祛瘀方聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖與凋亡的影響及機(jī)制研究Δ

趙秀梅，周 冰，張桂賢，柴仲秋，劉曉蕓，劉洪斌#(.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 30000;.天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院肛腸科，天津 30045)

扶正解毒祛瘀方聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖與凋亡的影響及機(jī)制研究Δ

趙秀梅1＊，周 冰2，張桂賢1，柴仲秋2，劉曉蕓2，劉洪斌1#(1.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020;2.天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院肛腸科，天津 300451)

目的:研究扶正解毒祛瘀方(簡(jiǎn)稱“扶正方”)聯(lián)合奧沙利鉑(L-OHP)對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖與凋亡的影響及機(jī)制。方法:將HT-29細(xì)胞分為空白對(duì)照組(不加藥物)、扶正方組(1 000mg/L)、L-OHP組(31.25mg/L)和聯(lián)合用藥組(1 000mg/L扶正方+31.25mg/L L-OHP)。加入相應(yīng)藥物作用48 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)法檢測(cè)細(xì)胞中促凋亡基因Bax、抑凋亡基因Bcl-2mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果:與空白對(duì)照組比較，L-OHP組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖均受到抑制、S期和G2/M期細(xì)胞比例升高、G0/G1期細(xì)胞比例降低(P＜0.05)，L-OHP組、扶正方組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率升高、細(xì)胞中BaxmRNA及蛋白的表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞中Bcl-2mRNA的表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，且聯(lián)合用組變化較兩藥單用組更明顯(P＜0.05)。結(jié)論:扶正方與L-OHP聯(lián)合應(yīng)用可抑制HT-29細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且作用優(yōu)于兩藥單用;其機(jī)制可能與上調(diào)細(xì)胞中Bax基因與蛋白表達(dá)、下調(diào)細(xì)胞中Bcl-2基因表達(dá)有關(guān)。

扶正解毒祛瘀方;奧沙利鉑;人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞;增殖;凋亡;體外

奧沙利鉑(Oxaliplatin，L-OHP)是繼順鉑、卡鉑后的第三代鉑類抗癌藥物，其通過(guò)產(chǎn)生烷化結(jié)合物作用于DNA，形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，從而抑制DNA的合成及復(fù)制。近年，含L-OHP在內(nèi)的FOLFOX4方案被推薦為Ⅱ、Ⅲ期大腸癌患者的一線治療方案[1-2]。但是在使用L-OHP的過(guò)程中仍出現(xiàn)了化療藥物所共有的問(wèn)題，如毒副作用大、患者耐受性差等。近年來(lái)，中醫(yī)藥治療已成為大腸癌綜合治療中重要的組成部分，尤其在增強(qiáng)大腸癌術(shù)后化療的抗腫瘤作用、減輕化療所致的毒副作用、輔助患者平穩(wěn)度過(guò)化療階段、降低術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率、延長(zhǎng)生存期等方面凸顯了其優(yōu)勢(shì)[3-5]。本課題組成員在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中，以參苓白術(shù)散、桃紅四物湯和小承氣湯為基礎(chǔ)，以扶正解毒祛瘀為立法依據(jù)，組方后得到扶正解毒祛瘀方(簡(jiǎn)稱“扶正方”)，針對(duì)大腸癌術(shù)后常見的氣虛毒瘀證型進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)扶正方在扶助體內(nèi)正氣及增強(qiáng)化療藥物抗癌效果作用的同時(shí)，還有通腑瀉濁、減輕化療毒副作用的功效，前期的研究也證實(shí)了扶正方有協(xié)同增加L-OHP抗腫瘤的作用[6]，但其作用機(jī)制尚不明確。為此，本研究分別通過(guò)MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)、Western blot等方法檢測(cè)扶正方聯(lián)合L-OHP對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖、凋亡的影響及可能的相關(guān)機(jī)制，希望為大腸癌的中西醫(yī)結(jié)合綜合治療提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

FACSCantoⅡ型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司);Light-Cycler 480Ⅱ型qRT-PCR儀(瑞士Roche公司);Infinite M 200型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(瑞士Tecan公司);IM型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 藥品與試劑

扶正方由太子參、慧苡仁、生槐花、知母、當(dāng)歸、黃柏、桃仁、紅花等中藥按照一定比例組成，由天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院提供，按照臨床用藥煎煮方法濃縮成每1 g含2.015 g生藥的浸膏，裝于密閉玻璃瓶中，4℃保存，批號(hào)為20150909，臨用時(shí)用含10%小牛血清的RPM I1640培養(yǎng)液制備成相應(yīng)濃度的藥液。

注射用L-OHP(南京制藥廠有限公司，批號(hào): 201411132，規(guī)格:50mg/瓶);MTT(美國(guó)Sigma公司);細(xì)胞周期、熒光素FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin-V FITC)凋亡檢測(cè)試劑盒(天津三箭生物技術(shù)有限公司，批號(hào):CY2001-O、AO2001-02P-G);兔源Bax、Bcl-2抗體(美國(guó)Santa Cruz公司);熒光定量試劑盒SYBR Green M ix(美國(guó)Roche公司);兔源β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體(美國(guó)CST公司);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);引物由北京Invitrogen生物技術(shù)公司合成。

1.3 細(xì)胞株

人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后，吹打成單細(xì)胞懸液，用含10%小牛血清的RPM I1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×105m L-1，接種于96孔板上，每孔100μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。然后將細(xì)胞隨機(jī)分為扶正方組(1 000mg/L)、L-OHP組(31.25 mg/L)和聯(lián)合用藥組(1 000 mg/L扶正方+31.25 mg/L L-OHP)，并另設(shè)不加藥物的空白對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，小心棄去上清，每孔加入MTT溶液(0.5 g/L)100μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔再加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150μL，用微量振蕩器振蕩10 m in使結(jié)晶物充分溶解。以酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔的光密度(OD)值，按下式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率:增殖抑制率(IR，%)=(1-給藥組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100%。

2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞，調(diào)整成密度為1×105m L-1的細(xì)胞懸液，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，貼壁24 h后，按“2.1”項(xiàng)下分組、給藥。然后將細(xì)胞置于37℃、5% CO2飽和溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

2.3 細(xì)胞周期測(cè)定

收集“2.2”項(xiàng)下作用48 h的HT-29細(xì)胞，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，離心，收集細(xì)胞沉淀，然后用70%冰乙醇溶液，在4℃下固定細(xì)胞24 h，再用PBS洗滌2次后將細(xì)胞重懸于PBS中。加核糖核酸酶A(終質(zhì)量濃度為50μg/m L)，于37℃水浴30m in，加入碘化丙啶(PI，終質(zhì)量濃度為20μg/m L)，避光，室溫孵育15m in，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期情況。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞凋亡測(cè)定

收集“2.2”項(xiàng)下作用48 h的HT-29細(xì)胞，PBS洗2遍，將細(xì)胞重懸于試劑盒配套的1×結(jié)合緩沖液(Binding buffer)中，用Annexin V與PI染料避光孵育15m in，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 細(xì)胞中Bax、Bcl-2mRNA表達(dá)檢測(cè)

收集“2.2”項(xiàng)下作用48 h的HT-29細(xì)胞，根據(jù)RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR擴(kuò)增以檢測(cè)各組細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)量。引物序列:β-actin，上游引物序列為5′-ATCAGCAAGCAGGAGTATG-3′，下游為5′-AATAAAGCCATGCCAATC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為105 bp;Bax，上游引物序列為5′-TCTGACGGCAACTTCAACTG-3′，下游為5′-AACCACCCTGGTCTTGGAT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為90 bp;Bcl-2，上游引物序列為5′-TGTTGTTCAAACGGGATTCA-3′，下游為5′-GAGCCAAGTGCAGCCACAATA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為120 bp。PCR反應(yīng)步驟:95℃、5 m in;95℃、20 s，60℃、20 s，72℃、20 s，50個(gè)循環(huán);72℃、5m in。總反應(yīng)體系為25μL。采用公式2-ΔΔct計(jì)算各基因表達(dá)的相對(duì)表達(dá)水平，其中Δct為目的基因ct值-內(nèi)參基因ct值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)檢測(cè)

收集“2.2”項(xiàng)下作用48 h的HT-29細(xì)胞，按總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白濃度，每孔蛋白上樣20μg，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，濕法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST緩沖液洗膜，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，次日取出，置于洗膜容器中，TBST緩沖液洗膜3次，加入二抗，于室溫下水平搖床上孵育1 h。避光條件下滴加發(fā)光液，反應(yīng)1m in。將PVDF膜置于凝膠成像儀中，根據(jù)條帶的亮度設(shè)置適當(dāng)?shù)钠毓鈺r(shí)間進(jìn)行曝光，保存圖片。將采集到的圖片用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參(β-actin)條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定結(jié)果

經(jīng)扶正方、L-OHP或二者聯(lián)合作用48 h后，HT-29細(xì)胞的增殖均受到不同程度的抑制。與空白對(duì)照組比較，L-OHP組及聯(lián)合給藥組細(xì)胞OD值顯著降低(P＜0.05)，且聯(lián)合用藥組細(xì)胞OD值顯著低于扶正方組和L-OHP組(P＜0.05)，結(jié)果詳見表1。

表1 各組細(xì)胞IR測(cè)定結(jié)果(±s，n=4)Tab 1 Determ ination results of cell IR in each group (±s，n=4)

表1 各組細(xì)胞IR測(cè)定結(jié)果(±s，n=4)Tab 1 Determ ination results of cell IR in each group (±s，n=4)

注:與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05;與聯(lián)合用藥組比較，#P＜0.05Note:vs.blank control group，＊P＜0.05;vs.combination group，#P＜0.05

IR，%組別空白對(duì)照組扶正方組L-OHP組聯(lián)合用藥組12.57±8.83 48.99±1.65 54.86±2.46 OD值0.736 7±0.040 1 0.644 1±0.053 1#0.3758±0.012 2＊#0.332 6±0.018 1＊

3.2 細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果

空白對(duì)照組細(xì)胞狀態(tài)良好，胞質(zhì)飽滿，相鄰細(xì)胞生長(zhǎng)融合成片;扶正方組細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)較空白對(duì)照組無(wú)明顯變化;而L-OHP組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞逐漸向圓形轉(zhuǎn)變，體積縮小，偽足回縮，細(xì)胞間隙增大、折光性變差，幾無(wú)片狀細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制明顯，尤以聯(lián)合用藥組細(xì)胞形態(tài)變化更為顯著，結(jié)果詳見圖1。

圖1 細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果(×100)Fig 1 Observation results of m orphlolgic changes(× 100)

3.3 細(xì)胞周期分布檢測(cè)結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，扶正方組G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞比例無(wú)明顯變化(P＞0.05);而L-OHP組及聯(lián)合用藥組S、G2/M期細(xì)胞比例顯著升高(P＜0.05)，G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低(P＜0.05)，細(xì)胞被阻滯在S期和G2/M期，結(jié)果詳見圖2、表2。

圖2 細(xì)胞周期分布圖Fig 2 Distribution chartof the cell cycle

表2 各組細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡率測(cè)定結(jié)果(±s，n= 3，%)Tab 2 Determ ination results of the cell cycle and apoptosis rate in each grou(p±s，n=3，%?)

表2 各組細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡率測(cè)定結(jié)果(±s，n= 3，%)Tab 2 Determ ination results of the cell cycle and apoptosis rate in each grou(p±s，n=3，%?)

注:與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05;與聯(lián)合用藥組比較，#P＜0.05Note:vs.blank controlgroup，＊P＜0.05;vs.combination group，#P＜0.05

細(xì)胞周期分布比例 細(xì)胞凋亡率2.7±0.1 11.5±1.8＊#19.2±1.8＊#28.0±1.2＊S組別空白對(duì)照組扶正方組L-OHP組聯(lián)合用藥組G0/G154.12±2.16 56.24±0.97#42.29±1.34＊40.06±2.65＊37.57±0.92 34.81±2.69#45.14±1.98＊44.57±1.48＊G2/M 8.32±1.24 8.96±1.72#12.58±0.64＊15.37±1.16＊

3.4 細(xì)胞凋亡測(cè)定結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，扶正方組、L-OHP組及聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P＜0.05)，且聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率顯著高于扶正方組和L-OHP組(P＜0.05)，結(jié)果詳見表2。

3.5 細(xì)胞中Bax、Bcl-2m RNA及蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，扶正方組、L-OHP組及聯(lián)合用藥組細(xì)胞中Bax mRNA及蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)，Bcl-2mRNA的表達(dá)減弱(P＜0.05)，且聯(lián)合用藥組變化程度較扶正方組和L-OHP組更明顯(P＜0.05);各給藥組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)均有所減弱，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果詳見圖3、表3。

4 討論

在前期體外試驗(yàn)中筆者曾發(fā)現(xiàn)，將濃縮后的中藥復(fù)方加入到培養(yǎng)體系中，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖時(shí)，鏡下觀察到高濃度樣品孔生成的甲臜顆粒明顯少于低濃度孔，但其測(cè)定出的OD值常常與低濃度樣品孔的OD值相當(dāng)，甚至超過(guò)低濃度孔，這說(shuō)明濃度較高時(shí)，中藥本身的顏色會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。為此，筆者在本研究中將配制后的扶正方藥液經(jīng)過(guò)0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，在除菌的同時(shí)還去除了藥液中不溶性顆粒，從而改善了藥液的澄清度。此外，加入MTT試劑前，先將細(xì)胞上清棄去，再加入由PBS緩沖液配制的低濃度MTT(0.5 g/L)溶液100μL，又進(jìn)一步減低了藥液本身對(duì)測(cè)定的影響，保證了試驗(yàn)結(jié)果的可信度。

圖3 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 3 Electrophoresis chart of Bax，Bcl-2 protein expressionsof cells in each group

表3 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2m RNA及蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果(±s，n=3)Tab 3 Determ ination results of the Bax，Bcl-2m RNA and protein expressions of cells in each group (±s，n=3)

表3 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2m RNA及蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果(±s，n=3)Tab 3 Determ ination results of the Bax，Bcl-2m RNA and protein expressions of cells in each group (±s，n=3)

注:與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05;與聯(lián)合用藥組比較，#P＜0.05Note:vs.blank control group，＊P＜0.05;vs.combination group，#P＜0.05

組別空白對(duì)照組扶正方組L-OHP組聯(lián)合用藥組Bax蛋白表達(dá)0.68±0.03 0.64±0.04 0.57±0.09 0.56±0.08 mRNA表達(dá)1.00±0.05 1.34±0.27＊#1.88±0.34＊#2.35±0.38＊蛋白表達(dá)0.91±0.02 1.04±0.03＊#1.34±0.04＊#1.69±0.11＊Bcl-2 mRNA表達(dá)1.00±0.06 0.70±0.16＊#0.48±0.05＊#0.35±0.10＊

前期實(shí)驗(yàn)中，筆者測(cè)定了不同質(zhì)量濃度的扶正方(390.63、781.25、1 562.5、3 125、6 250 mg/L)和L-OHP (3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125mg/L)作用48 h后對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果二者均呈濃度依賴性地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。中西醫(yī)結(jié)合抗腫瘤治療是今后的發(fā)展方向之一，在術(shù)后輔助化療中顯示了“增效減毒”的優(yōu)勢(shì)[7-8]。課題組成員在臨床實(shí)踐中明確發(fā)現(xiàn)，大腸癌患者術(shù)后化療期間以扶正方為輔助用藥，其化療副反應(yīng)少，且身體狀況平穩(wěn)，顯示了良好的效果。為此，在觀察扶正方與L-OHP合用后對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響時(shí)，筆者選擇了對(duì)細(xì)胞增殖抑制率在30%以下的1 000、2 000mg/L兩個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行考察，結(jié)果低、高質(zhì)量濃度的扶正方與L-OHP合用均具有協(xié)同增效作用[6]?？紤]到中藥本身對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾，故在本次試驗(yàn)中選擇1 000mg/L的作用濃度。L-OHP劑量選擇的是其半數(shù)抑制濃度(IC50)附近的濃度(31.25mg/L)，因?yàn)楫?dāng)劑量過(guò)大時(shí)，與扶正方合用后，L-OHP本身的抑制率與合用的抑制率差別往往不會(huì)太大，不利于評(píng)價(jià)合用后的效果。

腫瘤的發(fā)生與多種癌基因的激活和抑癌基因的失活有關(guān)。Bcl-2家族是最重要的凋亡調(diào)控基因，包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，前者包括Bax、Bak、Bad等，后者有Bcl-2、Bcl-xl和M cl-1等，兩者的比例決定了細(xì)胞的命運(yùn)。當(dāng)接受到上游信號(hào)后，促凋亡蛋白(如Bax)表達(dá)發(fā)生改變，從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上與Bcl-2或Bcl-xl形成二聚體，改變線粒體膜的通透性，從而引起細(xì)胞色素C的釋放。細(xì)胞色素C再與凋亡蛋白酶活化因子1結(jié)合，激活半胱氨酸蛋白酶9(Caspase-9)，進(jìn)而通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活下游的Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9-10]。本研究表明，L-OHP單用及與扶正方聯(lián)合作用于HT-29細(xì)胞后，均可明顯抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，上調(diào)細(xì)胞中BaxmRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞中Bcl-2mRNA的表達(dá)，使細(xì)胞被阻滯在S和G2/M期，且兩藥聯(lián)合后作用更顯著。以上結(jié)果說(shuō)明，扶正方和L-OHP聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，這可能是通過(guò)抑制Bcl-2mRNA轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)Bax mRNA轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制Bcl-2蛋白表達(dá)、促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)，最終抑制HT-29細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。本研究結(jié)果顯示，扶正方和L-OHP聯(lián)合用藥具有合理性，為進(jìn)一步完善大腸癌的聯(lián)合用藥方案提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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Study on the Effect and Its M echanism of Fuzheng Jiedu Quyu Formula Combined w ith Oxaliplatin on Proliferation and Apoptosis of Human Colon Cancer HT-29 Cell

ZHAO Xiumei1，ZHOU Bing2，ZHANG Guixian1，CHAIZhongqiu2，LIU Xiaoyun2，LIU Hongbin1(1.Tianjin Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences，Tianjin 300020，China;2.Dept.of Anorectal，TCM Hospital of Tianjin Binhai New Area，Tianjin 300451，China)

OBJECTIVE:To study the effect and itsmechanism of Fuzheng Jiedu Quyu formula(short for“Fuzheng formula”) combined w ith oxaliplatin(L-OHP)on human colon cancer HT-29 cell proliferation and apoptosis.METHODS:HT-29 cells were divided into blank control group(w ithout drugs)，F(xiàn)uzheng formula group(1 000 mg/L)，L-OHP group(31.25 mg/L)and combination group(1 000 mg/L Fuzheng formula+31.25 mg/L L-OHP).A fter cultured w ith corresponding drug for 48 h，MTT method was used to detect the cell proliferation;the changes of cellularmorphology were observed by invertmicroscope;flow cytometry was used to detect the cell cycle and apoptosis rate.Proapoptotic gene Bax，apoptotic gene Bcl-2 mRNA expressions were determined by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction method;Bax，Bcl-2 protein expressions were assayed by Western blot.RESULTS:Compared w ith blank control group，cell proliferation was inhibited in L-OHP group and combination group;cell proportion was increased in S stage，G2/M stage and decreased in G0/G1stage(P＜0.05).Cell apoptosis rate in L-OHP group，F(xiàn)uzheng formula group and combination group was increased;Bax mRNA and protein expression were up-regulated，Bcl-2 mRNA expression was downregulated(P＜0.05);and combination group changed more obviously than the single drug groups(P＜0.05).CONCLUSIONS:Fuzheng formula combined w ith L-OHP can inhibit HT-29 cell proliferation and promote its apoptosis，show ing better effects than either of the two drugs alone.Themechanism may be associated w ith up-regulation of Bax gene and protein expressions and down-regulation of Bcl-2 gene expressions in cells.

Fuzheng Jiedu Quyu formula;Oxaliplatin;Human colon cancer HT-29 cell;Proliferation;Apoptosis;in vitro

R735;R979

A

1001-0408(2017)19-2613-04

2016-11-11

2017-02-24)

(編輯:林 靜)

天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合科研課題(No. 13164);天津市濱海新區(qū)塘沽科技發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目(No.2013MS05-03);天津市濱海新區(qū)衛(wèi)生局一般扶持項(xiàng)目(No.2014BWKY014)

＊副研究員，碩士。研究方向:中藥藥理、腫瘤藥理。電話:022-27236112。E-mail:zxmm lg@eyou.com

#通信作者:研究員，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向:肝膽胰疾病。電話:022-27313851。E-mail:jtss@sina.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.06