豆粕有機質發酵液發酵條件的優化

段雅婕++陳晶晶++龐振才++胡玉林++李偉明++胡會剛

摘 要 對豆粕有機質發酵液的發酵條件進行優化，為香蕉枯萎病提供穩定、有效的生物學防治方法。研究采用單因素試驗考察不同因素對豆粕有機質發酵的影響，運用正交試驗對實驗條件進行優化，結果發現，豆粕有機質最佳發酵工藝為豆粕有機質混懸液稀釋5倍，紅糖濃度為2.0 g/100 mL發酵15 d。為豆粕發酵液進行規模化生產提供了數據支持。

關鍵詞 豆粕有機質 ；發酵液 ；發酵條件 ；優化

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.07.019

Optimization of Fermentation Conditions for Soybean Meal Fermented Liquid

DUAN Yajie CHEN Jingjing PANG Zhencai HU Yulin LI Weiming HU Huigang

（South Subtropical Crops Research Institute， CATAS / Ministry of Agriculture Key

Laboratory for Biology of Tropical Fruit Trees， Zhanjiang， Guangdong 524091）

Abstract The fermentation conditions for producing soybean meal fermented liquid was optimized and used to control banana fusarium wilt. Single factor experiment was designed to determine the effect of different factors on the soybean meal fermentation， based on which orthogonal experiments were arranged to optimize the experimental conditions. Some factors that had higher influence on the fermentation of soybean meal organic matter were selected. The orthogonal experiment showed that soybean meal suspension was diluted at a ratio of 1：5 with the brown sugar concentration of 2.0 g/100 ml and fermented for 15 days to produce better soybean meal fermented liquid. This provided data support for commercial production of soybean meal fermented liquid.

Keywords Soybean meal organic matter ； fermented liquid ； fermentation conditions ； optimization

香蕉枯萎病是香蕉生產上一種毀滅性病害，嚴重威脅著香蕉的正常生長。據檢測發現，目前香蕉枯萎病危害最為嚴重的是4號生理小種，其寄主的香蕉栽培品種范圍很廣，危害面積最大，是一種香蕉枯萎病的強致病菌，這種菌經過鑒定為真菌，毒性很強，對香蕉栽培生產造成的危險性和毀滅性最大[1-2]。目前，香蕉枯萎病的防治主要采用化學防治和輪作等農業防治措施，而上述防治方法均存在較多的問題[3-4]。經多項實驗及田間使用證明，防治土傳性病害較有效的方法是改善土壤微生物的群體作用[5]，而使用豆粕有機質發酵液有利于土壤微生物多樣性的恢復，可有效控制香蕉枯萎病的發病率，而且不會產生農藥殘留，不會產生抗藥性[6]。通過對豆粕有機質發酵液中微生物的分析，發現其中含有多種對香蕉枯萎病病菌具有拮抗作用的菌株，也是豆粕有機質發酵液防治香蕉枯萎病的主要原因[7]。不同的發酵方法和發酵對微生物的種類、數量產生決定性的影響[8-9]。在使用豆粕有機質防治香蕉枯萎病的過程中，蕉農一般采用傳統的自然發酵方法使豆粕有機質發酵，然后直接施用到蕉園中。由于發酵方法粗放，發酵過程中各種條件缺乏科學的管理和控制，施用到蕉園后，對香蕉枯萎病的防治效果差異巨大，難以達到穩定控制香蕉枯萎病發病的效果。本研究通過對豆粕有機質發酵液的發酵條件進行優化，以期摸索出生產豆粕有機質發酵液的最佳發酵條件，為香蕉枯萎病提供穩定、有效的生物學防治方法。

1 材料和方法

1.1 材料

豆粕有機質：南亞熱帶作物研究所，本實驗室保存。

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，自來水1 000 mL。

菌株：香蕉枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.cubense Snyder & Hansen，簡稱為Foc）為尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種，中國熱帶農業科學院海口實驗站/香蕉研究所，曾會才課題組提供。

儀器：振蕩器、搖床、三角瓶、涂玻棒、無菌操作臺、酒精燈、離心管、離心機、PCR儀等。

1.2 方法

1.2.1 影響因素的篩選

豆粕有機質磨碎，加水配制成1 g/mL的混懸液，按照不同的發酵方法分別進行發酵，發酵之后，取發酵液稀釋至10倍，備用。取Foc4菌絲塊（以下稱“靶標菌株”）接入PDA培養基平板中間，所得的豆粕發酵液接種在距靶標菌株菌絲塊2～3 cm處的四周，28℃培養1～2 d，每個處理設置3次重復，計算抑菌帶寬度的平均值。

抑制率%=（對照菌直徑-處理菌直徑）/（對照菌直徑-菌餅直徑）。

數據采用和統計軟件進行方差分析及多重比較。

1.2.2 豆粕有機質濃度的選擇

豆粕有機質分別稀釋至2、4、5、8、10、15倍，按照1.2.1的方法進行發酵，并測定不同稀釋濃度的豆粕有機質發酵后抑菌帶的寬度。比較豆粕有機質濃度對豆粕有機質發酵液抑菌效果的影響。

1.2.3 發酵基質的選擇

在豆粕有機質混懸液分別加入蔗糖、紅糖、麩皮、椰糠、玉米粉，按照1.2.1的方法進行發酵，并測定抑菌帶寬度。考察不同發酵基質對豆粕有機質發酵液抑菌效果的影響。

1.2.4 發酵基質濃度的選擇

根據1.2.1篩選出的基質，分別設定0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/100 mL 6個不同的濃度，按照1.2.1的方法進行發酵，并測定抑菌帶寬度。考察不同的基質濃度對發酵液抑菌作用的影響。

1.2.5 發酵時間的選擇

根據1.2.1篩選出的基質，按照1.2.1的方法進行發酵，并在第1、3、5、10、15、17 d取發酵液，分別測定其抑菌帶寬度。考察發酵時間對發酵液抑菌作用的影響。

1.2.6 發酵條件的優化

根據單因素的實驗結果，選擇豆粕有機質濃度、發酵基質濃度和發酵時間為考察因素，每個因素設置低、中、高水平進行正交試驗，分別測定各豆粕有機質發酵液的抑菌帶寬度。各因素水平如表1。

2 結果與分析

2.1 豆粕有機質濃度對發酵液抑菌效果的影響

隨著豆粕有機質稀釋倍數的增加，豆粕有機質發酵液的抑菌帶寬度呈先上升后降低的趨勢，稀釋5倍的抑菌帶寬度達到最大值。不同稀釋倍數的豆粕有機質發酵液的抑菌帶寬度如圖1。

2.2 不同發酵基質對發酵液抑菌效果的影響

通過在豆粕有機質混懸液中添加不同發酵基質，豆粕有機質發酵液的抑菌效果有不同程度的提高，抑菌帶寬度均有所增加，其中添加了紅糖的豆粕有機質發酵液抑菌效果最好，結果如表2。因此，本實驗中選擇紅糖作為發酵基質。

2.3 發酵基質濃度對發酵液抑菌效果的影響

隨著豆粕有機質混懸液中紅糖濃度的增加，豆粕有機質發酵液的抑菌效果逐漸增強，并在2.5 g/mL之后趨于穩定。

2.4 發酵天數對發酵液抑菌效果的影響

隨著發酵天數的增加，豆粕有機質發酵液的抑菌帶寬度呈先上升后下降的趨勢，并且在發酵第15 d時達到最大值，結果如圖3。

2.5 正交試驗對發酵條件的優化

根據單因素的試驗結果，選擇L9（34）正交表安排試驗，具體實驗如表3。

通過對正交試驗的結果分析可以看出，各因素對豆粕有機質發酵液抑菌效果影響從大到小依次為：C>B>A，最佳發酵工藝組合為A2B2C2，即豆粕有機質混懸液稀釋5倍，紅糖濃度為2.0 g/100 mL發酵15 d。

3 討論

生物防治是目前公認比較安全和有效的防控香蕉枯萎病的措施之一，并符合環保和有機食品要求[10]。有機質餅肥發酵而成的液體肥料能較好的抑制多種病原菌，降低作物的發病率[11]。抑制土傳病害需要依賴土壤微生物群體作用，土壤微生物群落結構越豐富、物種越均勻、多樣性越高時，抑制病原菌能力越強。豆粕有機質發酵液中微生物，尤其是其中的拮抗菌，是防治香蕉枯萎病的重要因素。而發酵條件對發酵產物中微生物的種類和數量起著決定性作用。本研究通過單因素對影響微生物的多項因素進行篩選，并通過正交試驗對豆粕有機質發酵條件進行優化，通過比較不同處理對香蕉枯萎病病菌的抑制作用，得到了豆粕有機質發酵的最優條件，即豆粕有機質混懸液稀釋5倍，紅糖濃度為2.0 g/100 mL發酵15 d。采用上述條件，發酵所得的豆粕有機質發酵液具有較好的抑菌效果。為豆粕發酵液進行規模化生產提供了數據支持，也為豆粕發酵液大范圍應用于香蕉枯萎病的防治提供理論依據。

由于土壤微生物是個非常復雜的系統，僅僅依賴該方法難以充分認識土壤微生物的多樣性和復雜性，需要結合分子生物學及其他方法，如可結合基因芯片、穩定同位素探針等技術更深入、全面了解土壤微生物信息。本實驗目前只對發酵液進行了平板抑菌實驗。因此，進行盆栽苗和大田香蕉植株的防治實驗，進一步優化豆粕有機質發酵液的發酵條件，以期形成相對成熟的豆粕有機質發酵方法，從不同角度深入認識土壤微生物多樣性變化，闡述其與香蕉枯萎病害發病程度的相互關系，為生態控制土傳病害提供技術支撐，以更好地發揮生物防治對香蕉枯萎病的防治效果，探索香蕉枯萎病生物防治的新途徑。

參考文獻

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