肢體遠(yuǎn)程與局部缺血預(yù)處理對大鼠背闊肌肌皮瓣缺血再灌注損傷影響的比較

林威威，施小彤，謝永果，王維，陳錫華，張輝(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，南寧530000)

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肢體遠(yuǎn)程與局部缺血預(yù)處理對大鼠背闊肌肌皮瓣缺血再灌注損傷影響的比較

林威威，施小彤，謝永果，王維，陳錫華，張輝
(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，南寧530000)

目的 比較局部缺血預(yù)處理和肢體遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理對大鼠背闊肌肌皮瓣缺血再灌注損傷的影響。方法 將40只大鼠隨機(jī)分為對照組、缺血組、局部缺血預(yù)處理組、肢體缺血預(yù)處理組各10只。對照組接受假手術(shù)，缺血組夾閉胸背動脈3 h后恢復(fù)血流灌注1 h，局部缺血預(yù)處理組夾閉肌皮瓣胸背動脈進(jìn)行預(yù)處理，肢體缺血預(yù)處理組夾閉右股動脈進(jìn)行預(yù)處理。采用缺血10 min后恢復(fù)血流灌注10 min進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理結(jié)束30 min后再重復(fù)缺血組操作。檢測缺血前(T0)、缺血3 h(T1)、再灌注1 h(T2)后各組血清一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET)水平，術(shù)后第5天光鏡下觀察背闊肌皮瓣的組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 與缺血組比較，局部缺血預(yù)處理組和肢體缺血預(yù)處理組在T1和T2時(shí)間點(diǎn)血清NO水平升高、ET水平降低(P均<0.05)，局部缺血預(yù)處理組和肢體缺血預(yù)處理組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與缺血組比較，局部缺血預(yù)處理組和肢體缺血預(yù)處理組術(shù)后第5天肌皮瓣組織病理學(xué)損傷減輕，局部缺血預(yù)處理組和肢體缺血預(yù)處理組的病理學(xué)變化比較無明顯差異。結(jié)論 局部缺血預(yù)處理和肢體遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理均能減輕大鼠肌皮瓣的缺血再灌注損傷，對肌皮瓣具有保護(hù)作用。

缺血再灌注損傷；缺血預(yù)處理；移植皮瓣；背闊肌肌皮瓣；胸背動脈；股動脈；大鼠

缺血再灌注損傷(IRI)是指缺血的器官和組織恢復(fù)血流灌注后，缺血性損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象[1]。背闊肌肌皮瓣是外科手術(shù)最常選用的移植皮瓣[2]，如何采取安全有效的措施減少因缺血再灌注損傷導(dǎo)致的肌皮瓣缺血壞死，對于提高手術(shù)療效、改善患者預(yù)后具有重要意義。局部缺血預(yù)處理是指某種器官受短暫的缺血刺激后產(chǎn)生的對隨后較長時(shí)間缺血損害的耐受性。近年研究顯示，局部缺血預(yù)處理和肢體遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理均可減輕各器官和組織的缺血再灌注損傷[3～5]，但二者的效果比較尚未見報(bào)道。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血液和組織液之間的屏障，分泌多種活性物質(zhì)來調(diào)節(jié)血管壁張力，在維持血管正常功能方面發(fā)揮重要作用[6]。一氧化氮(NO)和內(nèi)皮素(ET)是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)血管舒縮的重要因子，其血清水平能夠反映血管內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能和受損程度[7]。2015年5月～2016年3月，我們通過建立大鼠背闊肌肌皮瓣缺血再灌注損傷模型，從保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的角度，比較局部缺血預(yù)處理和肢體遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理對肌皮瓣缺血再灌注損傷的影響，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量250～300 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，禁食12 h，自由飲水。ELISA檢測試劑盒(上海心語生物科技有限公司)，酶標(biāo)儀(BioTek Instruments，美國)，光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 動物分組與模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對照組、缺血組、局部缺血預(yù)處理組、肢體缺血預(yù)處理組各10只。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，取俯臥位，從大鼠右側(cè)背部外側(cè)肋弓下緣至腋窩做一縱形切口，切開皮膚，分離背闊肌，結(jié)扎肋間動脈穿支，保留胸背動脈為惟一的供血血管，將4-0絲線穿于胸背動脈下。穩(wěn)定10 min后，局部缺血預(yù)處理組和肢體缺血預(yù)處理組分別用無損傷血管夾夾閉胸背動脈、右股動脈做缺血預(yù)處理，以背闊肌完全變?yōu)榍嘧蠟槿毖晒Φ臉?biāo)志；缺血10 min松開血管夾，恢復(fù)灌流10 min，重復(fù)3個(gè)循環(huán)，穩(wěn)定30 min后再進(jìn)行缺血3 h操作。缺血組夾閉胸背動脈3 h后恢復(fù)血流。對照組在胸背動脈處僅穿線，不結(jié)扎。整個(gè)過程保持大鼠肛溫在36～37 ℃。

1.3 血清NO、ET檢測 于缺血前(T0)、缺血3 h(T1)、恢復(fù)灌流后1 h(T2)分別于左股靜脈采集靜脈血0.5 mL，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液，使用酶標(biāo)儀采用ELISA法測定NO和ET水平。

1.4 大鼠背闊肌組織的病理形態(tài)學(xué)觀察 術(shù)后第5天切取大鼠背闊肌中間部分組織，4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、包埋、切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下(400倍)觀察背闊肌纖維、肌細(xì)胞和細(xì)胞核的病理形態(tài)學(xué)。

2 結(jié)果

2.1 各組血清NO、ET水平比較 各組T0時(shí)血清NO、ET水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與T0時(shí)比較，T1和T2時(shí)缺血組、局部缺血預(yù)處理組、肢體缺血預(yù)處理組NO水平降低，ET水平升高(P均<0.05)；與T1時(shí)比較，T2時(shí)缺血組、局部缺血預(yù)處理組、肢體缺血預(yù)處理組NO水平降低，ET水平升高(P均<0.05)；對照組各時(shí)間點(diǎn)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與對照組比較，T1和T2時(shí)缺血組、局部缺血預(yù)處理組、肢體缺血預(yù)處理組NO水平降低，ET水平升高(P均<0.05)；與缺血組比較，局部缺血預(yù)處理組、肢體缺血預(yù)處理組NO水平升高，ET水平降低(P均<0.05)；局部缺血預(yù)處理組與肢體缺血預(yù)處理組各時(shí)間點(diǎn)NO、ET比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清NO、ET水平比較

注：與同組T0時(shí)間點(diǎn)比較，aP<0.05；與同組T1時(shí)間點(diǎn)比較，bP<0.05；與對照組同一時(shí)間點(diǎn)比較，cP<0.05；與缺血組同一時(shí)間點(diǎn)比較，dP<0.05。

2.2 各組背闊肌病理組織切片觀察 對照組肌纖維均勻，染色均一，細(xì)胞核形狀正常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；缺血組肌纖維腫脹明顯，肌纖維斷裂，部分細(xì)胞核消失，細(xì)胞部分結(jié)構(gòu)破壞；局部缺血預(yù)處理組和肢體缺血預(yù)處理組肌纖維輕度腫脹，染色均一，肌肉纖維斷裂較少，細(xì)胞核形狀正常，輕度腫脹，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，兩者的病理形態(tài)學(xué)變化無明顯差異，均較缺血組明顯減輕。

3 討論

缺血再灌注損傷是指繼缺血本身對組織造成損傷后，重新恢復(fù)的血液供應(yīng)再次對組織內(nèi)的細(xì)胞造成損傷，可引起組織細(xì)胞的壞死和凋亡。其發(fā)生機(jī)制還不是很清楚，目前認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞屏障損傷、氧自由基損傷、NO生物利用率的減少、Ca2+超載、細(xì)胞炎癥、細(xì)胞凋亡、微循環(huán)障礙、血管通透性和滲漏的增加均在其中起到了重要的作用[8]。

缺血預(yù)處理是一種通過多次間斷短暫的重復(fù)缺血再灌注來減輕隨后持續(xù)缺血損傷的方法，可以減輕器官和組織的缺血再灌注損傷，可分為局部缺血預(yù)處理和遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理。局部缺血預(yù)處理是指某種器官受短暫的缺血刺激后產(chǎn)生的對隨后較長時(shí)間缺血損害的耐受性。Mounsey等[9]建立豬的背闊肌模型，行缺血預(yù)處理后給予4 h的缺血，發(fā)現(xiàn)背闊肌存活面積明顯提高，證實(shí)局部缺血預(yù)處理能夠減少肌肉缺血壞死。Lintz等[10]通過檢測血清中的細(xì)胞質(zhì)酶和細(xì)胞膜的降解產(chǎn)物來檢驗(yàn)局部缺血預(yù)處理對骨骼肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)局部缺血預(yù)處理能很好地避免缺血肌肉的糖元分解，保護(hù)肌肉免于損傷。遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理是在局部缺血預(yù)處理基礎(chǔ)上提出的，是指給予肢體或者其他遠(yuǎn)隔器官或組織短時(shí)間的非致死的缺血刺激，可以增加靶器官或組織對長時(shí)間缺血的耐受性，對靶器官和組織產(chǎn)生保護(hù)作用。近年來，有學(xué)者[11]提出肢體遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理的概念。Kuntscher等[12]建立大鼠上腹部的脂肪皮瓣缺血再灌注模型，夾閉大鼠后肢股動脈行缺血預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理組肌皮瓣壞死面積減少，認(rèn)為肢體缺血預(yù)處理能夠?qū)Υ笫蟾共咳我馄ぐ耆毖俟嘧p傷起到保護(hù)作用。Krag等[13]采用止血帶對豬的后肢進(jìn)行缺血預(yù)處理，然后對豬的背闊肌皮瓣進(jìn)行4 h缺血和7 h再灌注，發(fā)現(xiàn)肢體遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理可以減輕肌皮瓣的缺血再灌注損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與缺血組相比，局部缺血預(yù)處理組和肢體缺血預(yù)處理組肌纖維斷裂、肌細(xì)胞腫脹程度及肌細(xì)胞核的病理形態(tài)學(xué)改變明顯減輕。說明局部缺血預(yù)處理和肢體遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理均可以減輕大鼠背闊肌肌皮瓣的缺血再灌注損傷。

NO是一種生物信使分子，廣泛分布于生物體內(nèi)，具有舒張血管平滑肌的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞可以通過一氧化氮合成酶(NOS)將L-精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸來合成NO，合成的NO作用于血管壁中平滑肌細(xì)胞，激活鳥苷酸環(huán)化酶，增加環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)生成，引起血管平滑肌細(xì)胞舒張，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞和組織的目的[14]。ET是由21個(gè)氨基酸殘基組成的活性多肽，是迄今所知最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，可以激活鈣通道增加Ca2+內(nèi)流，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞收縮，繼而引起血管收縮，血流量減少，細(xì)胞水腫，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[15]。NO和ET是維持血管內(nèi)皮功能的重要生物活性分子。正常情況下，血管舒張因子NO釋放和血管收縮因子ET釋放處于相對平衡狀態(tài)，以NO略占優(yōu)勢，以便于保持血流的流動；當(dāng)組織遭遇長時(shí)間的缺血損害時(shí)，血管內(nèi)皮功能發(fā)生障礙，引起內(nèi)皮依賴的舒血管因子NO減少，內(nèi)皮依賴的縮血管因子ET增多，NO/ET比例失衡，導(dǎo)致血管痙攣、異常收縮、加重組織壞死。因此，可以通過檢測NO和ET的含量間接評價(jià)血管內(nèi)皮功能。Jankauskas等[16]在抗氧化劑對大鼠腎臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究中，觀察到缺血再灌注可引起大鼠腎臟血管收縮，血管阻力增加，腎血流量減少，內(nèi)皮細(xì)胞破壞，減少了NO的生成，導(dǎo)致腎臟功能的衰竭，得出內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙在組織的缺血再灌注損傷中起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，在缺血3 h和再灌注1 h，缺血組血清NO水平降低，ET水平升高；術(shù)后5 d觀察病理組織學(xué)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)大鼠的肌肉纖維腫脹明顯，大部分肌肉纖維斷裂及部分細(xì)胞核消失，說明缺血3 h再灌注1 h對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能造成了損傷，繼而加重了大鼠背闊肌皮瓣缺血壞死。與缺血組相比，局部缺血預(yù)處理組和肢體缺血預(yù)處理組血清NO水平降低幅度及ET水平升高幅度均降低，兩組間血清NO、ET比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明局部缺血預(yù)處理和肢體遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理均可以減輕缺血再灌注對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害，進(jìn)而減輕大鼠背闊肌肌皮瓣的缺血再灌注損傷。

綜上所述，局部缺血預(yù)處理和肢體遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理均能減輕大鼠肌皮瓣的缺血再灌注損傷。局部缺血預(yù)處理是直接在血管蒂上進(jìn)行缺血預(yù)處理操作，在臨床中可能會損傷吻合的血管并延長手術(shù)時(shí)間，給臨床操作帶來不便；而肢體遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理由于操作簡便，無損傷性，且不延長手術(shù)時(shí)間，因此具有更好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目(S201411-02)。

施小彤(E-mail: hbb38@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.010

R622

A

1002-266X(2017)26-0035-03

2016-12-26)