喀斯特土壤固氮微生物群落與植被、土壤的關系

劉 璐,何尋陽,杜 虎,王克林,*

1 中國科學院亞熱帶農業生態研究所亞熱帶農業生態過程重點實驗室, 長沙 410125 2 湖南省農業生物技術研究中心,長沙 410125

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喀斯特土壤固氮微生物群落與植被、土壤的關系

劉 璐1,2,何尋陽1,杜 虎1,王克林1,*

1 中國科學院亞熱帶農業生態研究所亞熱帶農業生態過程重點實驗室, 長沙 410125 2 湖南省農業生物技術研究中心,長沙 410125

固氮微生物作為土壤中重要的功能微生物群之一,其與地上植物群落、土壤環境之間的關系尚不清楚。在桂西北的環江縣、都安縣和大化縣選取喀斯特典型植被類型(草叢、灌叢、次生林)建立樣方,通過植被調查、測定土壤理化性質和構建克隆文庫的方法,研究了土壤固氮微生物群落的結構與組成,分析了固氮微生物群落與植物群落、土壤理化性質之間的關系。結果表明：研究區典型植被類型土壤中的優勢固氮微生物為慢生根瘤菌。Mantel相關性分析表明植物群落與固氮微生物群落顯著相關(r=0.6116,P=0.011)；結合PCoA分析和Venn圖可看出,植物群落組成與結構越相似,土壤固氮微生物群落結構與組成也越相似。CCA分析前兩軸的解釋率之和僅為22.72%,其中總氮、有效態鉀、有效態鈣對固氮微生物群落的影響顯著,這表明本研究涵蓋的土壤理化性質指標并不能完全解釋固氮微生物群落的變異,需要補充更多的土壤數據進行更深入的研究。由此可見,在喀斯特生態恢復過程中,不僅要關注地上植被群落的恢復與重建,同時也應重視地下功能微生物群落的恢復與重建。

固氮微生物群落；nifH基因；植被恢復；喀斯特

固氮微生物是生態系統中一類重要的功能菌群,它在土壤氮素循環中發揮著不可取代的作用,其群落結構組成對土壤氮素固定及維持氮素循環平衡具有重要意義[1- 2]。固氮微生物中均含有編碼鐵蛋白的nifH基因,基于該基因的分子生物學分析為固氮微生物群落結構及多樣性的探索提供了一個較傳統培養更為靈敏和準確的分析方法[3- 4]。大量研究表明,固氮微生物群落的結構與組成受土地利用方式、施肥制度、土壤理化性質(如pH、SOC、TN)等因素的影響,如長期施加氮肥會使土壤固氮微生物的競爭力下降,進而改變其多樣性、群落結構與組成[5- 7]。越來越多的研究表明,地上植物群落與土壤微生物群落存在著不可分割的相互聯系,地上植物群落通過凋落物和根系分泌物影響土壤微生物的種類和豐度,而土壤微生物通過改變土壤環境、影響養分礦化過程等方式影響地上植物群落的多樣性、群落結構及生產力[8-10]。然而,目前對固氮微生物群落與地上植物群落相互聯系的研究相對較少,它們之間是否存在緊密的相關性尚不清楚。

西南喀斯特地區是我國生態環境最脆弱的地區之一,強烈的人為干擾(如火燒、放牧、樵采等)導致原有植被大面積破壞,水土流失加劇,石漠化嚴重,生態恢復與重建迫在眉睫[11-12]。前期研究表明,氮素是喀斯特植被恢復的重要限制性因素之一,生物固氮作為自然生態系統氮素輸入的主要來源,是解決退化生態系統氮素限制的最好方式[13- 15]。長期以來,研究者多從地上植物的角度(自然封育和人工造林)提出喀斯特退化生態系統的恢復措施,對喀斯特生態恢復過程中植被與土壤環境的耦合關系已有較深入的認識[16- 17]。目前,對喀斯特生態系統的地下生物過程,尤其是對土壤功能微生物(如固氮微生物、叢枝真菌)的研究相對較少,缺乏對植被恢復過程中固氮微生物群落的變化及與地上植物群落、土壤環境之間關系的認識。

本文以桂西北3個縣(都安、大化、環江)為研究區域,選取喀斯特典型植被類型(草叢、灌叢、次生林),建立動態監測樣地,進行植被調查,采集土壤樣品,運用PCR-克隆-測序技術,明確了喀斯特典型植被類型的固氮微生物群落組成特征,探討了固氮微生物群落與地上植物群落之間的相互關系,揭示了土壤環境對固氮微生物群落的影響,以期能為喀斯特地區生物固氮潛力的開發及生態恢復與重建提供參考數據和科學指導。

1 研究區域與研究方法

1.1 研究區概況

研究區位于桂西北河池市(23°41′—25°37′ N, 106°34′—109°09′ E),具有典型喀斯特地貌,土壤量少且分布零散,巖石裸露率較高。2011年8月,選取研究區內的典型生態系統(草叢、灌叢、次生林),分別在環江縣大才鄉、都安縣三只羊鄉、大化縣七百弄鄉建立樣方(每個地點同植被類型樣方各3個重復),各樣方的面積為20 m × 30 m,坡位、坡向和地質背景基本一致。

大才鄉概況 位于環江毛南族自治縣東南部,24°44′N,108°19′E附近。該區屬亞熱帶季風氣候,年平均氣溫16.5—20.5℃,年平均降水量1389.1 mm,降水分布不均,雨季4—9月降水占年總降水量的70%。該區為典型的喀斯特峰叢洼地,土壤量少且分布零散。

三只羊鄉概況 位于都安瑤族自治縣北部,24°26′N,108°02′E附近。該區屬亞熱帶季風氣候,多年平均氣溫19.6℃,年平均降水量1492.2 mm,年平均蒸發量1644.9 mm,相對濕度74%,>10℃年積溫平均值7289.5℃,年日照平均值1395.5 h。逐月降水分布不均,雨季5—8月降水占年總降水量的67.8%,春旱、秋旱較頻繁。地貌類型以典型的高峰叢洼地為主,土壤量少且分布零散,境內原生植被極少,森林覆蓋率不足10%。

圖1 研究區域分布情況Fig.1 The location of study area

七百弄鄉概況 地處大化瑤族自治縣西北部,24°08′N,107°40′E附近。該鄉屬亞熱帶季風氣候區,年均氣溫17.4—19.6℃,年降雨量1500—1600 mm,雨水多集中于夏季。該區屬最典型的峰叢洼地巖溶類型,大面積巖石裸露,石漠化嚴重,植被稀少,以灌木叢為主,森林覆蓋率在5%以下。研究區域見圖1。

1.2 野外調查與樣品采集

植被調查：每塊樣方分成6個10 m× 10 m的小樣方調查植被組成。對于草叢樣方,在每個小樣方中選取1個2 m× 2 m的樣方進行調查；對于灌叢樣方,在每個小樣方中選取1個4 m× 4 m的樣方進行調查；對于次生林樣方,則調查全部面積。分3層調查植被多樣性：對于喬木層,記錄物種名、胸徑、數量；對于灌木層,記錄物種名、基徑、數量；對于草本層,記錄物種名、數量。目測各物種的蓋度和高度。

土壤采集：在每個樣方內,沿“S”型采集0—20 cm表層土壤15個點,混合成一個樣品。在滅菌牛皮紙上除去大石塊和動植物殘體,并混合均勻后,用四分法分取100 g左右的土,用錫箔紙包好后放入滅菌布袋中,立刻投入液氮罐中速凍,帶回實驗室經冷凍干燥、磨細分裝后放入-70℃冰箱保存,用于提取微生物DNA；剩下的土壤風干,磨碎過篩后裝入自封袋中,用于土壤理化性質的測定。

1.3 樣品測定與分析

1.3.1 土壤固氮微生物分析

土壤樣品中微生物DNA提取方法參照Porteous等的SDS-GITC-PEG方法[18]。采用PolF(5′-TGCGAYCCSAARGCBGACTC- 3′)和PolR(5′- ATSGCCATCATYTCRCCGGA- 3′)擴增土壤微生物總DNA中的nifH基因片段[3]。每個樣品重復擴增3次,將3次的擴增產物混合均勻以消除單次擴增的偏向性。20 μL PCR反應體系為：2 × EasyTaq PCR Super Mix 10 μL,引物各1 μL(2.5 μmol/L),DNA模板約40 ng,補充ddH2O 至20 μL。擴增條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,35個循環；72℃ 7 min。

采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根,中國)進行凝膠回收純化。將回收獲得的nifH基因片段連接到pMD19-T載體上(寶生物,大連),轉化進入大腸桿菌DH5α高感受態細胞,將轉化產物涂布到含有氨芐青霉素/IPTG/X-Gal的LB培養基上,37℃培養16—24 h,每個樣品挑取200個白色克隆子,采用菌落PCR的方法,用引物PolF/PolR擴增外源插入片段,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測篩選陽性克隆,構建基因克隆文庫。

1.3.2 土壤理化性質測定

土壤pH的測定采用電位法(水土比2.5∶1)；土壤全碳、全氮的測定采用碳氮元素分析儀(Elementar,Germany)；土壤有效態P、K、Fe、Ca、Mg采用Orr等的Mehlich 3法浸提,浸提液過濾后直接上機(ICP-MS,GBC)測定[5]。

1.4 數據處理

(1)重要值計算

草本層重要值：IV=(相對多度+相對頻度+相對蓋度)/3

灌木層重要值：IV=(相對多度+相對頻度+相對顯著度)/3

喬木層重要值：IV=(相對多度+相對頻度+相對顯著度)/3

相對顯著度=(樣方中該種個體胸面積和/樣方中全部個體胸面積總和)×100%。

相對多度=(樣方中該種的個體數/所有種的總個數)×100%。

相對頻度=(樣方中該種的頻度/所有種的頻度總和)×100%。

相對蓋度=(樣方中該種的分蓋度/樣方中全部個體蓋度之和)×100%。

(2)克隆文庫序列分析

測得的序列首先去除載體和嵌合體序列,將最后所得序列與GenBank 數據庫中已知種類的序列進行比對,以確定各序列的種屬信息。按93%序列相似性劃分OTU,用Mothur軟件(http://www.mothur.org/)生成OTUs的分類,進行聚類分析和繪制Venn圖。采用覆蓋度(C)來表征克隆文庫的代表性,計算公式為C=1-n/N,n為克隆文庫中僅出現過一次的OTUs數,N為克隆文庫總克隆子數目。

描述性統計和方差分析在Excel 2010和SPSS 18.0軟件中進行。采用Canoco 5軟件中的主坐標分析法來分析植物群落結構與組成的差異；采用CCA分析土壤理化因子對固氮微生物群落的影響。

2 結果與分析

2.1 典型植被類型的植物群落組成及差異

圖2 植物群落結構與組成的PCoA分析 Fig.2 PcoA analysis of plant community composition and structure 形狀代表植被類型。圓形：草叢；菱形：灌叢；正方形：次生林;顏色代表區域。橙色：環江地區；綠色：都安地區；紫色：大化地區

各樣方的植物群落優勢種名錄見表1。環江地區,草本層以五節芒(Miscanthusfloridulus)、翠云草(Selaginellauncinata)等為優勢種；灌木層以檵木(Loropetalumchinense)、豹皮樟(Litseacoreana)、四籽海桐(Pittosporumtonkinense)等為優勢種；喬木層以青岡櫟(Cyclobalanopsisglauca)、檵木等為優勢種。都安地區,草本層以類蘆(Neyraudiareynaudiana)、石山棕(Guihaiaargyrata)等為優勢種；灌木層以紅背山麻桿(Alchorneatrewioides)、灰毛漿果楝(Cipadessabaccifera)等為優勢種；喬木層以瓊楠(Beilschmiediaintermedia)、假玉桂(Celtistimorensis)等為優勢種。大化地區,草本層以五節芒、腎蕨(Nephrolepiscordifolia)等為優勢種；灌木層以廣西密花樹(Myrsinekwangsiensis)、紅背山麻桿等為優勢種,喬木層以化香(Platycaryastrobilacea)為優勢種。不同植被類型的植物群落組成存在較明顯的差異(圖2)。其中,都安、大化地區同類型植被的群落結構較為相似,聚集在一起,而環江地區植被與都安、大化地區植被存在明顯的差異。

表1 各樣方的優勢群落組成

括號中為該物種在各樣方中的重要值; GL: grassland; SL: scrubland; SF: secondary forest. H: herbaceous; S: shrub; A: arborous;扭肚藤(Jasminumelongatum),天仙果(Ficuserecta),粗絲木(Gomphandratetrandra),紫葉秋海棠(Begoniapurpureofolia),粗毛懸鉤子(Rubusalceifolius),毛蕨(Cyclosorusinterruptus),烏斂莓(Cayratiajaponica),子凌蒲桃(Syzygiumchampionii),綢緞藤(Bauhiniahypochrysa),箬竹(Indocalamustessellatus),剛莠竹(Microstegiumciliatum),蘭香草(Caryopterisincana),一葉萩(Flueggeasuffruticosa),棕竹(Rhapisexcelsa),陰香(Cinnamomumburmannii)

2.2 典型植被類型土壤的基本理化性質

研究區域土壤接近于中性土,pH介于6.4—7.8之間。隨著植被從草叢向次生林的演變,土壤養分狀況也隨之發生了明顯的改變,其中土壤總N明顯增加(表2)。方差分析結果表明,土壤總C、總N、有效態Fe、Mg、Ca均受植被類型和地理區域的共同影響,且植被與地理區域存在交互效應(表3)。其中,土壤有效態K主要受植被類型的影響(F=7.71,P=0.004),地理區域對其無顯著影響(F=0.05,P=0.95)；而土壤pH、有效態P主要受地理區域的影響(F=4.08,P=0.035；F=4.51,P=0.026),但植被類型對其無顯著影響(F=2.29,P=0.13；F=0.87,P=0.435)。

表2 各樣方的土壤理化性質

表3 植被類型和地點對土壤理化性質的影響

2.3 典型植被類型的固氮微生物群落差異

由于各克隆文庫的克隆子數目相差較大,因此從每個克隆文庫中隨機挑取70個克隆子(3個重復),保證3個區域克隆文庫的克隆子數量基本相同(約200個)。每個克隆文庫的覆蓋度均超過60%,表明克隆文庫能夠基本代表該區域的土壤固氮微生物群落的多樣性。在GenBank數據庫中對序列進行比對,發現土壤中的優勢固氮微生物為慢生根瘤菌。

按照93%序列相似性劃分OTU,根據Bray-curtis指數計算距離,得到相似性矩陣,進行群落結構差異分析。由Venn圖可見(圖3),3個地區共有的OTUs數目僅為9個,其中都安、大化地區共有的OTUs數目為39,而都安和環江、大化和環江之間共有的OTUs數目分別為19、21個,表明都安、大化地區的土壤固氮微生物群落組成更相似,由此可見,植物群落結構更相似,土壤固氮微生物群落也更相似。Mantel相關性分析進一步表明植物群落與固氮微生物群落顯著相關(r=0.6116,P=0.011)。同樣地,不同植被類型下土壤固氮微生物群落也發生了明顯的變化,其中草叢與灌叢、灌叢與次生林、草叢與次生林共有的OTUs數目分別為30、31、19個,這表明：隨著植被的正向演替,土壤固氮微生物群落的改變有個漸變的過程。

圖3 固氮微生物的群落差異分析Fig.3 The variance analysis of nitrogen-fixing microbial communityDA：都安縣；DH：大化縣；HJ：環江縣;GL：草叢；SL：灌叢；SF：次生林

圖4 固氮微生物群落與土壤理化性質的CCA分析 Fig.4 CCA analysis of diazotroph communities and soil properties 帶箭頭的實線表示土壤理化因子(解釋變量),三角形代表固氮微生物群落

由圖4可見,CCA分析前兩軸的解釋率之和僅為22.72%,這表明本研究涵蓋的土壤理化性質指標并不能很好的解釋固氮微生物群落的變異。但總氮、有效態鉀、有效態鈣對固氮微生物群落影響顯著(P<0.05)。總體來說,土壤固氮微生物群落受植物群落與土壤條件的共同影響。

3 討論

本文采用克隆文庫的方法,研究了區域尺度上不同植被類型下土壤固氮微生物群落差異。nifH基因是研究固氮微生物的marker基因,它的系統發育分析與16S rDNA基因高度一致,因此常用于進行固氮微生物多樣性的研究[19- 22]。對于16S rDNA基因,一般將序列相似性>97%歸為一個OTU(種),而對于功能基因如何劃分種無統一標準。已有的研究表明,16S rDNA基因的序列相似性>97%,其nifH基因序列相似性可能低于95%,甚至低至85%,利用nifH基因序列只能估算物種多樣性,并不能真實反映樣品中固氮微生物的遺傳多樣性[4]。不同的研究者往往采用不同的序列相似性(93%—97%)來劃分OTU,本文參照Hsu等人的研究,按93%的序列相似性來劃分OTU并進行后續的分析[21]。

以往的研究,多關注固氮微生物群落對施肥制度、土地利用方式和植被變化的響應,對群落尺度上固氮微生物群落與植物群落相關性的研究較少[23-24]。 Tai等[19]研究表明小葉金露梅灌木群落和黑褐苔草牧草地的固氮微生物群落存在顯著差異,由此可見固氮微生物群落與地上植物群落密切相關。本研究從群落尺度水平上,采用Venn圖和Mantel相關性分析研究了固氮微生物群落與地上植物群落的關系。結果表明,兩者之間顯著相關,植物群落結構越相似,固氮微生物群落也越相似。研究區域內的頂級植被群落屬于中亞熱帶石灰巖區常綠落葉闊葉混交林,草叢、灌叢和次生林都是由于干擾程度不同退化而成[12]。都安、大化地區屬于深峰叢洼地,峰頂海拔多為800—1000 m,洼地、谷地海拔為600—800 m,地貌較為相似,因此其植被群落組成與結構也較接近。環江地區屬低中山峰叢洼地,海拔介于442—637 m之間,其植被群落組成與結構與都安、大化地區有明顯差異。地上植物群落結構與組成的變化導致凋落物的質量和根系分泌物存在差異,間接影響固氮微生物種間的競爭力,從而使整個固氮微生物群落結構與組成發生改變[25]。

土壤理化性質是影響固氮微生物群落的另一重要因素。已有的研究表明,pH、全氮、全碳、全鉀、碳氮比和有效態磷都會顯著影響固氮微生物群落的多樣性與結構[6, 19, 26]。本研究中,總氮、有效態鉀、有效態鈣顯著影響固氮微生物群落,這與之前的研究結論一致。固氮微生物在氮素缺乏的土壤中更具競爭優勢,土壤氮素含量的變化會影響固氮微生物與其它土壤微生物的競爭關系,從而影響固氮微生物的群落組成[27]；而土壤有效態鈣可能通過影響固氮酶活性來影響固氮微生物群落。綜上所述,地上植物群落、土壤環境、固氮微生物群落三者之間相互影響,存在協同演變機制。今后研究中,有必要從物種的水平上,具體分析固氮微生物與植物、土壤因子之間的耦合機制。

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The relationships among nitrogen-fixing microbial communities, plant communities, and soil properties in karst regions

LIU Lu1,2, HE Xunyang1, DU Hu1, WANG Kelin1,*

1KeyLaboratoryofAgro-ecologicalProcessesinSubtropicalRegion,InstituteofSubtropicalAgriculture,ChineseAcademyofSciences,Changsha410125,China2HunanAgriculturalBiotechnologyResearchCenter,Changsha410125,China

Soil nitrogen-fixing microorganisms are one of the most important functional microorganisms; however, their relationship with plant communities and soil conditions is poorly understood. In the present study, three typical karst regions (Huanjiang, Du′an, and Dahua) were selected and quadrats were established in typical vegetation types (grassland, scrubland, and secondary forest). A total of 27 quadrats (3 replicates for each vegetation type) were established and the size of each quadrat was 20 m × 30 m. The composition and structure of plant communities were studied by vegetation surveys, soil properties were determined, and the structure and composition of soil nitrogen-fixing microorganisms were analyzed by building clone libraries and sequencing. Following that, the relationships between nitrogen-fixing microbial communities, plant communities, and soil conditions were explored. Principal coordinates analysis indicated that the composition and structure of the plant communities were obviously different between vegetation types. Comparing plant communities among the three regions, the Du′an and Dahua regions were found to have similar plant composition and structure. Soil properties also differed between vegetation types and regions. Total carbon, total nitrogen, and available Fe, Ca, and Mg were affected by vegetation type and region, while available K was mainly affected by vegetation type and pH, and available P was mainly affected by region. BLAST results indicated that the predominant nitrogen-fixing microbial species in our study area belonged to the genusBradyrhizobium. The composition of nitrogen-fixing microbial communities varied across both vegetation types and regions. There were only nine shared operational taxonomic units (OTUs) among the three regions, and only eleven shared OTUs in the three vegetation types. The number of shared OTUs between the Du′an and Dahua regions was 39, which was much higher than that of the Huanjiang region. This indicated that the composition and structure of plant communities were similar to each other, as were the composition and structure of the soil nitrogen-fixing microbial communities. Mantel correlation analysis also showed that soil nitrogen-fixing microbial communities and plant communities were significantly correlated (r= 0.6116,P= 0.011). From the canonical correspondence analysis, the cumulative explanation of the first two axes was only 22.72%, which could not fully explain the variation in the nitrogen-fixing microbial communities. Total nitrogen, available potassium, and available calcium had a significant effect on the nitrogen-fixing microbial communities. This suggests that further research is required to determine additional soil properties. In conclusion, soil nitrogen-fixing microbial communities, plant communities, and soil conditions were mutually affected by each other. Therefore, during the process of karst ecological restoration and reconstruction, it is important that both the aboveground vegetation and the belowground functional microbial communities are given equal attention.

nitrogen-fixing microbial community;nifHgene; re-vegetation; karst

國家重點研發計劃項目(2016YFC0502400)；國家自然科學基金項目(31400412,31270551)

2016- 06- 14;

2017- 01- 16

10.5846/stxb201606141146

*通訊作者Corresponding author.E-mail: kelin@isa.ac.cn

劉璐,何尋陽,杜虎,王克林.喀斯特土壤固氮微生物群落與植被、土壤的關系.生態學報,2017,37(12):4037- 4044.

Liu L, He X Y, Du H, Wang K L.The relationships among nitrogen-fixing microbial communities, plant communities, and soil properties in karst regions.Acta Ecologica Sinica,2017,37(12):4037- 4044.