4-氯-2-(1H-咪唑并[4，5-f][1，10]菲咯啉)苯酚銅配合物的晶體結構及其與DNA的相互作用

寇瑩瑩 任相浩

4-氯-2-(1H-咪唑并[4，5-f][1，10]菲咯啉)苯酚銅配合物的晶體結構及其與DNA的相互作用

寇瑩瑩＊任相浩

(北京市可持續城市排水系統構建與風險控制工程技術研究中心，城市雨水系統與水環境教育部重點實驗室，北京建筑大學，北京 100044)

利用菲咯啉酮衍生物4-氯-2-(1H-咪唑并[4，5-f][1，10]菲咯啉)苯酚(HL)設計合成了一種新的單核銅配合物[Cu(L)(5-Cl-sal) (DMF)]ClO4·DMF(5-Cl-Hsal=5-氯-水楊醛)，用元素分析和X射線單晶衍射等手段對配合物進行了表征。該配合物晶體屬三斜晶系，P1空間群。用紫外吸收光譜、熒光光譜和凝膠電泳等方法研究了配合物與DNA的相互作用。結果表明，配合物以插入方式與CT-DNA結合，結合常數為1.02×103L·mol-1。同時配合物也能較大程度淬滅EB-DNA復合物的熒光，表觀鍵合常數為4.37× 105L·mol-1，略小于經典鍵合常數107L·mol-1。淬滅機理為動態淬滅。凝膠電泳實驗研究表明配合物在H2O2存在下可將pBR322質粒DNA切割為開環缺口型DNA和線型DNA，配合物濃度越大，切割效果越好。機理研究顯示，配合物切割DNA的反應是由羥基自由基(·OH)和單線態氧(1O2)作為活性物種的氧化切割過程。

單核；銅配合物；晶體結構；DNA；斷裂

過渡金屬銅離子是人體必需的生命元素之一，是多種酶的活性中心，并且由于具有較高的氧化還原電位，使得Cu配合物具有良好的化學核酸酶活性[1]。多年來，銅配合物由于具有良好的水溶性和生物活性可以作為DNA探針、抗菌藥物、抗腫瘤藥物、人工核酸模擬酶等[2-8]。

銅配合物的配體多為含氮雜環類配體，其中最重要的一類為菲咯啉及1，10-菲咯啉-5，6-二酮衍生物配體，它們在藥學、生命科學等領域發揮了重要作用[9-12]。因此，以菲咯啉及1，10-菲咯啉-5，6-二酮衍生物為配體的過渡金屬銅配合物就成為了生物化學家們研究人工化學核酸模擬酶的熱點之一[13]。

本文選用1，10-菲咯啉-5，6-二酮衍生物4-氯-2-(1H-咪唑并[4，5-f][1，10]菲咯啉)苯酚(HL)為配體設計合成了一個新型的單核銅金屬配合物[Cu(L)(5-Cl-sal)(DMF)]ClO4·DMF(5-Cl-Hsal=5-氯-水楊醛)，用元素分析和X射線單晶衍射等手段對配合物結構進行了表征。而后又用電子吸收光譜和熒光光譜等方法研究了配合物與CT-DNA的相互作用；并用瓊脂糖凝膠電泳對配合物的化學核酸酶活性及其機理進行了研究。研究結果對將菲咯啉酮衍生物-銅配合物發展為高效的人工化學核酸酶以及探尋新的DNA結構探針具有一定的指導意義。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

小牛胸腺DNA(CT-DNA)(BR)和pBR322質粒DNA，購自華美生物工程公司；溴化乙錠(EB)(AR)，Fluka公司產品；瓊脂糖，購自Sigma公司，西班牙進口分裝；其他試劑和溶劑均為分析純產品，購自北京國藥集團化學試劑有限公司。

元素分析(C，H，N)﹑紅外光譜、核磁共振、質譜、紫外可見吸收光譜和熒光光譜分別用Perkin-Elmer 240型元素分析儀、Bruker Vector 22型傅立葉變換紅外光譜儀、Bruker AM-400超導傅立葉數字化核磁共振儀 ((TMS為內標，DMSO-d6為溶劑)、Bruker MAXIS高分辨質譜儀 (德國Bruker公司)、JASCOUV-570型紫外可見分光光度計和MPF-4型熒光光譜儀測定。凝膠電泳儀采用恒壓恒流DYY-Ⅲ型電泳儀。凝膠成像使用UVITEC Cambridge凝膠分析成像系統獲得。

1.2 配體HL的制備

配體HL的結構如圖1所示，其合成方法參照文獻[14]，將其中的對甲基苯甲醛替換為5-Cl-Hsal。元素分析按 C19H11ClN4O計算值 (%)：C，65.81；H，3.20；N,16.16；實驗值(%)：C,65.72；H，3.24；N，16.18。FT-IR(KBr，cm-1)：3 442(N-H)；3 227(C-H)；3 061(OH)；1 667，1 627，1 566，1 486(C=C，苯環骨架振動)；1 611(C=N，芳雜環)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 8.80(d，2H)；8.00(d，2H)；7.32(s，1H)；7.26(m，2H)；7.05 (d,1H)；6.73(d,1H)；5.00(s，2H)。MS(m/z)：346.06([M]+)。

圖1 配體HL的結構Fig.1 Structure of ligand HL

1.3 配合物[Cu(L)(5-Cl-sal)(DMF)]ClO4·DMF的制備

0.3 mmol Cu(ClO4)2·6H2O溶于5 mL CH2Cl2，加入0.3 mmol HL的10 mL CH2Cl2/DMF溶液和0.3 mmol的5-Cl-Hsal，磁力攪拌8 h，過濾得綠色溶液。室溫下緩慢揮發溶劑，5周后得適于X射線衍射的綠色單晶。產率：40%，元素分析按C32H28Cl3CuN6O9計算值(%)：C，47.42；H，3.48；N，10.37。實驗值(%)：C，47.32；H，3.53；N，10.40。

1.4 配合物的晶體結構測定

配合物的晶體結構測定采用Rigaku Saturn型X射線衍射儀，低溫下采用經石墨單色器單色化的Mo Kα射線(λ=0.071 073 nm)作入射光源，以ω-2θ掃描方式收集衍射點。非氫原子坐標用直接法解出，并對他們的坐標及其各向異性熱參數進行用全矩陣最小二乘法修正。氫原子的位置由理論加氫得到，并使用騎式換型位置參數和固定的各向異性熱參數加入結構精修。所有的計算使用SHELXS-97和SHELXL-97程序包進行[15-16]。有關衍射分析的實驗條件、結構解析、修正方法和晶體學數據在表1中列出。

表1 配合物的數據收集和處理參數Table 1 Crystaldata and structure refinement for the complex

CCDC：702844。

2 結果與討論

2.1 配合物的晶體結構描述

配合物的晶體結構解析表明，它是由1個[Cu (L)(5-Cl-sal)(DMF)]+、1個ClO4-和1個游離的DMF分子構成。[Cu(L)(5-Cl-sal)(DMF)]+的晶體結構如圖2所示，部分鍵長和鍵角數據見表2。在[Cu(L)(5-Clsal)(DMF)]+中，銅離子與1個配體L上的2個氮原子、1個5-Cl-sal上的2個氧原子和1個DMF分子上的1個氧原子配位，從而形成畸變的四方錐構型。按照Addison/Reedijk幾何標準，應用公式τ=(βα)/60計算得到的參數τ，是三角錐化結構程度指數。標準的四方錐和標準的三角雙錐的τ值分別為0和1。基于計算，配合物的τ=0.08。N3、N4、O2和O3四個原子位于赤道平面，O4位于頂點位置。銅離子背離平面距離為0.012 7 nm。

圖2 [Cu(L)(5-Cl-sal)(DMF)]+的透視圖及原子編號Fig.2 Labeled scheme of[Cu(L)(5-Cl-sal)(DMF)]+

2.2 配合物的化學核酸酶活性研究

2.2.1 配合物與DNA相互作用的電子吸收光譜

研究

配合物的電子吸收光譜隨CT-DNA濃度的變化如圖3(a)所示。配合物濃度為1μmol·L-1，加入CT-DNA后，隨著DNA濃度的增加，配合物的電子光譜吸收峰位置紅移9 nm，峰強度降低，即為“減色效應”。通常減色效應伴隨著紅移現象[17]；增色效應伴隨著藍移現象[18]。配體插入后與DNA堿基對發生了π電子堆積，配體的π*空軌道與堿基對的π軌道發生偶合，使π→π*躍遷幾率減小，從而使得紅移現象越來越明顯，吸收峰逐漸降低，即配合物與DNA發生了插入作用[19]。

表2 配合物中部分鍵長(nm)和鍵角(°)

Table 2 Selected bond lengths(nm)and angles(°)for the complex

Cu-O2 0.188 7(3) Cu-O3 0.195 8(3) Cu-O4 0.226 3(3) Cu-N3 0.201 4(3) Cu-N4 0.200 1(3) O2-Cu-O3 93.71(13) O2-Cu-N3 90.14(13) O2-Cu-N4 168.40(13) O2-Cu-O4 91.47(12) O3-Cu-N3 173.01(12) O3-Cu-N4 92.70(13) O3-Cu-O4 90.52(12) O4-Cu-N3 95.21(12) O4-Cu-N4 98.14(12) N3-Cu-N4 82.56(14)

圖3 配合物與CT-DNA作用的電子吸收光譜圖 (a)和C DNA/(εa-εf)～C DNA關系圖 (b)Fig.3 Absorption spectra of complex when interacting with CT-DNA(a)and plot of C DNA/(εa-εf)vs C DNA(b)

為了進一步定量地比較配合物和CT-DNA的親和力的大小，根據配合物電子吸收峰強度隨DNA濃度的變化，用下列公式計算了配合物與DNA作用的結合常數Kb[20]。

公式中CDNA表示DNA堿基對的濃度，εa，εb和εf分別表示Aobsd/(bCcomplex)，完全結合后的配合物的摩爾吸光系數和自由配合物的摩爾吸光系數。以CDNA/ (εa-εf)對 C DNA作圖(圖 3(b))，直線方程為 y=1.75× 10-6x+1.71×10-9，所得直線的斜率與截距的比值即為結合常數Kb，為1.02×103L·mol-1。研究結果表明，配合物以插入方式與DNA結合。

2.2.2 配合物與EB-DNA相互作用的熒光淬滅研究

溴化乙錠(EB)本身沒有熒光，與DNA結合后，EB分子插入到DNA堿基對中，受到DNA中疏水環境的保護產生強烈的熒光，避免了其激發態與水分子間發生能量交換產生非輻射淬滅，因此EBDNA有熒光。當加入配合物后，配合物奪取EBDNA分子中的DNA分子，使其濃度降低產生的熒光被部分淬滅。如圖4(a)所示，隨著配合物濃度的增加，EB-DNA熒光強度逐漸降低，表明配合物與CTDNA的競爭結合取代了EB。

圖4 (a)配合物淬滅EB-DNA的熒光光譜圖;(b)在25和0℃下的配合物淬滅EB-DNA的Stern-Volmer圖Fig.4 (a)Fluorescence quenching curves of EB bound to DNA by the complex;(b)Stern-Volmer plots for EB bounding to DNA by the complex at 25 and 0℃

根據Stern-Volmer方程式[21]，以加入配合物前后EB-DNA的熒光強度比值(I0/I)為縱坐標，配合物的濃度為橫坐標，做出Stern-Volmer圖(圖4(a)插圖)。配合物的熒光淬滅曲線呈直線，基本上滿足了Stern-Volmer方程,表明熒光淬滅是配合物取代了已插入DNA的EB的結果。根據方程KEBCEB=KappCcomplex, KEB=1.0×107L·mol-1(CEB=4.0μmol·L-1)，計算出配合物的表觀鍵合常數為4.37×105L·mol-1，略小于經典鍵合常數107L·mol-1[22]，說明配合物與CT-DNA之間為中等鍵合作用。

熒光淬滅是指激發態的熒光分子通過各種外轉換過程失去能量使熒光強度降低。靜態淬滅是基態熒光分子與淬滅劑之間通過弱的結合生成復合物，且該復合物使熒光完全淬滅。而動態淬滅是激發態熒光分子與淬滅劑之間由分子碰撞作用而使其熒光淬滅。為了弄清配合物的淬滅機理，我們研究了不同溫度下(0、25℃)配合物對EB-DNA復合物熒光的影響。如圖4(b)所示，應用Stern-Volmer方程：I0/I=1+KCcomplex對測試數據進行擬合，得到較好的線性關系。動態淬滅一般是由于擴散作用，且隨著溫度升高，斜率K應該增大。由圖4(b)可以看出配合物是動態淬滅機理[23]。

2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳的研究

用瓊脂糖凝膠電泳法對配合物進行了DNA切割研究。配合物的化學核酸酶活性主要依賴于配合物本身的性質、濃度以及反應時間等因素。當配合物與超螺旋質粒DNA作用后，如果能引起DNA閉環超螺旋上的一條鏈出現一個缺口時，閉環超螺旋結構就變成開環缺口型；而當2條鏈在同一位置都發生斷裂時，就變成線性結構。3種結構的質粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移速率不同，閉環超螺旋由于結構緊密，通過凝膠向正極移動，走在最前面(FormⅠ)，其次是線型(FormⅢ)，而開環缺口型由于結構松散，向正極移動受到抑制，走在最后面(FormⅡ)[24]。因此，將配合物與pBR322質粒DNA混合恒溫，在接近生理條件下(pH=7.2，37℃)測定了配合物的化學核酸酶活性。研究表明在氧化還原劑H2O2(25μmol·L-1)存在下，配合物才具有化學核酸酶活性，如圖5所示。相同恒溫時間條件下，配合物可將pBR322質粒DNA由Form I轉化為FormⅡ，隨著配合物濃度的增加，繼續轉化為FormⅢ。濃度越大，DNA斷裂程度越大。

為了探討配合物對DNA的切割機理，在有氧的條件下，CH2O2=25μmol·L-1，Ccomplex=100μmol·L-1，恒溫3 h，研究了幾種可能的抑制劑：羥基自由基(·OH)淬滅劑DMSO，超氧態陰離子自由基(O2·-)淬滅劑SOD，單線態氧(1O2)的抑制劑NaN3和金屬離子螯合劑EDTA等對配合物切割活性的影響[25]。

圖5 不同濃度配合物在H2O2(25μmol·L-1)存在下與pBR322質粒DNA的凝膠電泳圖Fig.5 Agarose gel electrophoresis of pBR322 plasmid DNA treated with complex with addition of hydrogen peroxide with different concentrations

圖6 不同抑制劑下配合物(100μmol·L-1)在H2O2(25μmol·L-1)存在下與pBR322質粒DNA的凝膠電泳圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis of pBR322 plasmid DNA treated with C complex=100μmol·L-1 in the presence of H2O2 (25μmol·L-1)and potential inhibitor agents

圖6是配合物在加入不同抑制劑的切割作用機理凝膠電泳圖。由圖可以看出，超氧態陰離子自由基(O2·-)淬滅劑 SOD(Lane 3)存在下，配合物對DNA的斷裂沒有明顯改變，排除了超氧態陰離子自由基是反應過程中的活性物種的可能性。在羥基自由基(·OH)淬滅劑DMSO(Lane 2)和單線態氧(1O2)的抑制劑NaN3(Lane 4)存在下，配合物對DNA的斷裂減弱，表明了羥基自由基和單線態氧可能是反應過程中的活性物質。Lane 5表示在EDTA存在下，配合物對DNA的斷裂減弱。實驗結果表明，配合物切割DNA的反應是由羥基自由基和單線態氧作為活性物種的氧化切割過程。

3 結 論

本文通過電子吸收光譜、熒光光譜和瓊脂糖凝膠電泳等方法研究了新型單核銅配合物[Cu(L)(5-Clsal)(DMF)]ClO4·DMF的化學核酸酶活性。結果表明，配合物與CT-DNA以中等強度的插入方式發生作用，結合常數為1.02×103L·mol-1；與EB-DNA熒光淬滅的表觀鍵合常數為4.37×105L·mol-1，略小于經典鍵合常數107L·mol-1。淬滅機理為動態淬滅。在H2O2存在下，配合物具有DNA切割活性，配合物濃度越大，切割效果越好。在有氧條件下機理研究發現羥基自由基(·OH)和單線態氧(1O2)很可能是DNA切割反應中的活性物種。因此，可以推測配合物切割DNA的反應是由羥基自由基(·OH)和單線態氧(1O2)作為活性物種的氧化切割過程。本實驗結果為今后設計更高效的銅配合物人工化學核酸酶和抗癌藥物等提供了有價值的信息。

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Crystal Structure and DNA Interaction Property of CuComplex with 4-Chloro-2-(1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)phenol

KOU Ying-Ying＊REN Xiang-Hao
(Beijing Engineering Research Center of Sustainable Urban Sewage System Construction and Risk Control, Key Laboratory of Urban Stormwater System and Water Environment,Beijing University of Civil Engineering and Architecture,Beijing 100044,China)

A new mononuclear copper complex[Cu(L)(5-Cl-sal)(DMF)]ClO4·DMF(5-Cl-Hsal=5-chloro-salicylaldehyde)has been designed and synthesized by phenanthroline derivatives 4-chloro-2-(1H-imidazo[4,5-f][1,10] phenanthrolin-2-yl)phenol(HL).It was characterized by element analysis and X-ray single crystal diffraction.The crystal structure of complex belongs to triclinic system with space group P1.Interactions of the complex with DNA binding have been investigated by absorption spectroscopy,fluorescence spectroscopy and agarose gel electrophoresis.The spectrophotometric studies show that the mode of binding of the complex could be intercalation and its binding constant Kbis 1.02×103L·mol-1.At the same time the complex can quench EB-DNA complexes to a large extent.The apparent binding constant value for the complex is 4.37×105L·mol-1,which is slightly less than the classical bond constant 107L·mol-1.In addition,the quenching mechanism of complex is dynamic quenching.The agarose gel electrophoresis showed that the complex can cleave circular pBR322 plasmid DNA to both nicked and linear forms with addition of hydrogen peroxide,and the higher theconcentration,the better the cutting effect.The cleavage mechanism between the complex and plasmid DNA is likely to involve singlet oxygen1O2and hydroxyl radical·OH as reactive oxygen species.CCDC:702844.

mononuclear;copper complex;crystal structure;DNA;cleavage

O614.121

A

1001-4861(2017)08-1429-06

10.11862/CJIC.2017.157

2017-03-12。收修改稿日期：2017-06-01。

北京建筑大學博士啟動基金(No.00331614012)和北京市教育委員會2016年度科技計劃一般項目(No.KM201610016006)資助。

＊通信聯系人。E-mail：kouyy@bucea.edu.cn