紫外線消毒對大腸桿菌的損傷及復蘇的研究

徐麗梅,許鵬程,張崇淼,王曉昌(西安建筑科技大學環境與市政工程學院,西北水資源與環境生態教育部重點實驗室,陜西 西安 710055)

紫外線消毒對大腸桿菌的損傷及復蘇的研究

徐麗梅,許鵬程,張崇淼*,王曉昌**(西安建筑科技大學環境與市政工程學院,西北水資源與環境生態教育部重點實驗室,陜西 西安 710055)

調查了紫外線消毒后大腸桿菌的光復活和暗修復能力,分析了紫外線消毒對細胞膜、三磷酸腺苷以及核酸(DNA、RNA)的損傷,結合recA的SOS損傷修復機制,闡述大腸桿菌對紫外線的響應機制.結果表明:20mJ/cm2紫外線劑量下,大腸桿菌去除率為5.63-log,且經光復活和暗修復24h后,光復活和暗修復百分比分別達到0.018%和0.00042%,光復活能力明顯大于暗修復能力.紫外線消毒過程DNA的損傷取決于片段長度,長片段16s rRNA的基因損傷更明顯,水處理常規的紫外線消毒劑量對總ATP含量和膜的完整性影響較小,為紫外線消毒過程的復蘇提供了基本保障.然而紫外線消毒對大腸桿菌的RNA損傷較嚴重,紫外劑量達到50mJ/cm2時,大腸桿菌失去了SOS損傷修復的能力,因此培養法檢測80mJ/cm2時大腸桿菌的復蘇能力極弱,recA相關的RNA的消失可用于指示微生物發生了不可逆損傷.

紫外線；復蘇；膜完整性；三磷酸腺苷；DNA；RNA

消毒過程作為水處理過程中的最后的一道壁壘,主要用于殺滅病原微生物保障水質的安全.紫外線消毒由于其能高效的滅活細菌、病毒和原生動物以及消毒副產物量少等優勢[1-3],在污水、再生水、飲用水處理過程中已得到廣泛應用.但是紫外線消毒不能提供持久性消毒效果,在長期的儲存和可見光的照射下,微生物能通過自身損傷修復機制發生復蘇現象,使水質指標無法達到使用和回用標準,產生安全健康風險[4-6].目前,已被證實存在復蘇現象的微生物種類繁多,主要包括:細菌(例如:大腸埃希氏菌、糞鏈球菌、鼠傷寒沙門氏菌、鮑曼不動桿菌、鏈霉菌屬等)、真菌(青霉菌屬、酵母屬)、原生動物(隱孢子蟲、藍氏賈第鞭毛蟲)[4-9].大腸桿菌作為糞便污染的指示菌,已成為水處理檢測中一項重要的衛生學指標,用于指示水傳播疾病發生風險的可能性[10-11].因此了解紫外線消毒過程中大腸桿菌的復蘇現象,對于保證出水水質安全具有重要的意義.

研究報道,紫外線消毒對微生物損傷的作用位點在核酸上,其主要以紫外線消毒過程細胞內物質對紫外光的吸收為依據,即紫外線很容易被微生物的DNA所吸收發生光化學反應,形成嘧啶二聚體和6-4光產物,因此紫外線消毒主要是破壞微生物的核酸[12-13].目前對于紫外線消毒的大多數研究仍停留在宏觀的以培養為基礎的研究,其缺點是培養法無法用于檢測亞致死的或處于活的但不可培養狀態的細菌存在,而對微觀的分子水平損傷的研究仍較少.有研究表明由于 RNA在非活性菌中能迅速被降解,RNA的存在能更好反應微生物的活性[14],其中recA基因是重要的SOS損傷修復機制[15-16],因此recA相關的RNA的消失可能用于指示微生物的完全失活.

本文以糞便污染指示菌—大腸桿菌為研究對象,分析了紫外線消毒過程中大腸桿菌的滅活、光復活和暗修復現象,并借助流式細胞儀技術、熒光發光檢測儀和PCR技術,進一步分析了紫外線消毒對細胞膜、三磷酸腺苷以及DNA、RNA的損傷,結合recA的SOS損傷修復機制,闡述大腸桿菌對紫外線壓力的響應機制.

1 材料與方法

1.1 微生物

美國菌種保藏中心購買的大腸桿菌 E. coli (ATCC 25922),接種于液體LB培養基中,37℃搖床中200rpm培養12～16h, 1000g離心10min,得到細胞懸濁液,用磷酸緩沖液(PBS, pH=7.2)沖洗2次,進行10倍稀釋得到不同濃度的E. coli菌液,作為后續指示性細菌.

1.2 紫外線消毒

向直徑為 90mm的培養皿中加入接種大腸桿菌的40mL PBS水樣,大腸桿菌的起始濃度約為106CFU/mL,把培養皿放到準平行光紫外線照射器的紫外燈下,培養皿下置磁力攪拌器,輕輕攪拌水樣,通過調節紫外線照射時間達到不同的紫外線輻射劑量,輻射一定時間后將水樣取出,4℃保存,用于后續分析.每個實驗重復3次,試驗所用紫外燈的功率為 15W(波長 254nm),試驗中紫外線強度為 0.10mW/cm2,紫外線輻射劑量(mJ/cm2)=紫外線強度(mW/cm2)×輻射時間(s).

1.3 復蘇過程

1.3.1 光復活過程 采用15W的日光燈研究紫外線照射后菌株的光復活情況.提前開啟日光燈預熱 20min,將經紫外線照射的水樣轉移至日光燈下 20cm,采用磁力攪拌子輕輕攪拌水樣,延長光照時間分別為0、2、4、6、8、12、16、20、24h,測定不同光復活時間后大腸桿菌的濃度.

1.3.2 暗修復過程 經紫外線照射后的水樣進行避光保存,采用磁力攪拌子輕輕攪拌水樣,使暗處理時間分別為0、2、4、8、24h,檢測不同暗處理時間后大腸桿菌的濃度.

1.4 細菌計數過程

試驗過程采用膜過濾平板計數方法分析大腸桿菌的濃度,5mL水樣經10倍系列稀釋后,采用直徑 50mm孔徑 0.22μm的混合纖維膜過濾,置于m-FC培養基上,于37℃培養24h后進行菌落計數分析.

1.5 損傷機制研究

1.5.1 流式細胞儀分析膜的完整性 結合使用PI和SYBR Green I來表征紫外線消毒過程中細菌的膜的完整性損傷,將10μL的SYBR GreenⅠ加入1mL的二甲基亞砜中制成SYBR GreenⅠ儲備液后,將PI(30mM)和SYBR GreenⅠ儲備液以1:100的比例混合,避光于-20℃保存.將經紫外線照射后的PBS水樣進行10倍稀釋使細菌總濃度達到 103～104cells/mL,取 0.5mL的樣品加入5μL的染料,于30℃避光染色15min后,采用BD Accuri C6?流式細胞儀(BD Accuri cytometers,美國)進行樣品分析,測定0.5mL樣品中的30μL細菌狀態,流式細胞儀光源為488nm氣冷氬離子激光,其中經SYBR Green I(綠色熒光)染色的大腸桿菌通過FL1通道,而經PI(紅色染料)染色的受損的大腸桿菌通過FL3通道.

1.5.2 三磷酸腺苷(ATP)的檢測 采用發光檢測儀(LB 962CentroLIA/PC,德國)分析消毒過程中ATP的含量,實驗所用試劑為BacTiter-GloTM(Promega,美國),將 100μL樣品加入不透明多孔板中,加入等體積的BacTiter-GloTM試劑,在定軌振蕩器上振蕩混勻 1min后,測定熒光強度.采用ATP粉末(Sigma, A2383)配置不同濃度的ATP標準品,建立ATP與熒光強度的標線,通過測定樣品的熒光強度推算樣品中總ATP的含量.

1.5.3 DNA、RNA的損傷 大腸桿菌水樣經14000r/min 4℃離心 20min,棄上清液,收集菌體,參照細菌基因組 DNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司,DP2001)說明提取總DNA,作為DNA損傷分析的模板.參照細菌RNA提取試劑盒(Omega, R6950-01,美國)說明提取細菌總RNA,并參照 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara, DRR047A) 進行反轉錄實驗,得到cDNA作為后續RNA損傷分析的模板.

為了確定消毒過程中核酸的損傷程度,分別采用通用引物U968:AACGCGAAGAACCTTAC和 L1401:GCGTGTGTACAAGACCC分析 16s rRNA 的 434bp片段損傷,以及引物 27f: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 和 1492r: GGTTACCTTGTTACGACTT分析16s rRNA的1450bp 片段損傷.實驗采用引物 recA-f: GTTGGACTGCTTCAGGTTAC 和 recA-r: AGGTAAAACCTGTGCGTTTA分析SOS損傷修復機制相關的RNA的損傷.PCR反應體系:2μL DNA或 cDNA,0.25μL的 Ex Taq (Takara,中國),2.5μL 的 10×Ex Taq Buffer, 2μL dNTP Mixture, 400nM 的上游和下游引物,加去離子水使總體系達到25μL.反應程序為:起始95℃ 5min 95℃ 30s,不同退火溫度(引物U968/L1401: 58℃,引物 27f/1492r:54℃,引物 recA-f/recA-r: 60℃) 30s,72℃延伸1min,共35個循環;最后72℃延伸4min.PCR產物采用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳,經DuRed核酸染料染色后,利用凝膠成像儀對擴增;結果進行分析.

1.6 數據分析

紫外線消毒過程,大腸桿菌的去除率按下式計算

利用復活百分比來衡量已被紫外線殺滅的大腸桿菌中,復活的大腸桿菌所占的比例,公式如下

式中:N0為紫外線照射前水樣中的大腸桿菌數量, CFU/mL; N為紫外線照射后水樣中的大腸桿菌數量, CFU/mL); NP為光復活或暗修復后水樣中的大腸桿菌數量, CFU/mL.

2 結果

2.1 紫外線消毒對大腸桿菌的滅活

紫外線消毒對大腸桿菌的滅活如圖 1所示.隨紫外劑量的增加,大腸桿菌迅速被滅活,當紫外劑量達到水處理常用的20mJ/cm2,大腸桿菌的平均去除率達到了 5.63-log.隨紫外劑量增加,紫外線對大腸桿菌的滅活進入拖尾階段,拖尾主要是由于微生物表面性質發生變化產生的自我聚集現象引起的[17].當達到歐盟飲用水處理標準[18]的40mJ/cm2以及美國環保署規定的中水回用技術標準[19]的 80mJ/cm2時,大腸桿菌的平均去除率分別達到6.2-log和6.25-log,幾乎完全被滅活.

圖1 紫外線消毒對大腸桿菌的滅活Fig.1 Inactivation of E. coli under UV disinfection

2.2 紫外線消毒后大腸桿菌的復蘇現象

消毒后的水樣在進入下游水域,在自然光的條件下具有光復活現象,此外在黑暗條件下也存在一定的暗修復現象,因此本研究進一步調查了紫外線消毒后大腸桿菌的復蘇現象,結果如圖 2所示.

圖2 紫外線消毒后E. coli的復蘇Fig.2 Reactivation of E. coli after UV disinfection

隨時間延長,大腸桿菌濃度明顯增加,光復活百分比(表 1)和暗修復百分比(表 2)明顯增加,然而光復活的程度明顯高于暗修復的程度,例如經5mJ/cm2紫外線輻射后,復蘇時間長達 24h,大腸桿菌的光復活達到最大值 5.06×105CFU/mL,復活百分比達到 10.5%,大腸桿菌暗修復達到最大值1.2×105CFU/mL,暗修復百分比達到了1.98%,由于日光燈為復蘇現象提供一定的能量,更有利于消毒后大腸桿菌的復蘇.經 20mJ/cm2紫外線輻射后24h,大腸桿菌的復活百分比為0.018%,與郭等[20]低日光燈復活光強下復活 72h的 0.02%一致,但明顯低于高日光燈復活光強 43 μW/cm2下的光復活百分比 5.97%,因此復活光強作為光復活的一個重要因素具有不可忽視的作用.

表1 不同時間下E. coli的光復活百分數(%)Table 1 Photo-reactivation percentage (%) of E. coli after different light exposure times

表2 不同時間下E. coli暗修復百分數(%)Table 2 Dark repair percentage (%) of E. coli after different dark repair times

紫外線消毒復活的原因主要是紫外線消毒產生亞致死或處于活的但不可培養狀態的菌株的復蘇[21].隨紫外線輻射劑量的增加,光復活和暗修復百分比明顯減少,當紫外線輻射劑量達到40和80mJ/cm2,在較短的恢復時間下(0～8h),幾乎不存在光復活現象,如表1所示,延長光復活時間,光復活百分比仍然較低僅為 0.0037%～0.0059%.相似的高的紫外劑量下(40和80mJ/cm2),隨暗修復時間的延長,大腸桿菌的濃度基本保持不變(圖 2b),暗修復百分比僅為 0.000009%～0.0013% (表 2),因此水處理過程中使用較高的紫外劑量(40和 80mJ/cm2)有利于控制紫外線消毒后的復蘇現象,高紫外劑量下對大腸桿菌的損傷較嚴重,亞致死的細胞數目明顯減少.

2.3 紫外線消毒對大腸桿菌的作用機制

2.3.1 紫外線消毒對大腸桿菌細胞膜的損傷對紫外線消毒前后大腸桿菌進行流式細胞儀分析,結果如圖3所示.P2區代表細菌的細胞膜未受損傷(PI染色陰性),P3+P4表示細菌的細胞膜受到損傷(PI染色陽性).未經處理的水樣中完整細胞膜細胞的數目占總數目的 86.3%,經95℃熱處理 15min后,采用流式細胞儀分析,有95.6%的細胞膜受到損傷,因此流式細胞儀能用來判斷細胞膜的損傷.然而紫外線消毒過程未導致更嚴重細胞膜的損傷,細胞膜未受損傷的細胞百分比保持在 84.3%～89%范圍,即使紫外劑量增加至300mJ/cm2仍有84.3%的細胞膜保持其完整性.因此水處理常用的紫外消毒劑量對大腸桿菌的細胞膜的損傷微乎其微.Cho和李等[22-23]采用TEM透射顯微鏡和OPNG降解分析紫外線消毒對大腸桿菌的損傷,結果表明消毒后大腸桿菌的細胞膜仍保持一定的完整性,細胞通透性略微增加,胞內物質出現一定的固縮現象.

圖3 采用流式細胞儀分析紫外線消毒中E. coli膜完整性Fig.3 FCM detection of the membrane integrity of E. coli during UV disinfection

2.3.2 紫外線消毒對ATP的損傷 三磷酸腺苷(ATP)是微生物代謝活動的主要能源,因此 ATP的濃度能近似的反應微生物的活性和新陳代謝能力[24-25].該研究進一步探索了紫外線消毒過程對大腸桿菌總ATP含量的影響,結果如圖4所示.在低紫外劑量下(＜100mJ/cm2),紫外線對大腸桿菌ATP含量無明顯影響,有輕微的增加趨勢.隨紫外線劑量進一步增加(＞100mJ/cm2) ATP含量呈下降趨勢,大腸桿菌丟失其代謝能力.

2.3.3 紫外線消毒對大腸桿菌 DNA的損傷 過去研究表明紫外線消毒主要引起微生物核酸的損傷,本研究采用分子生物學的 PCR檢測方法分析了紫外線消毒過程對大腸桿菌16s rRNA基因的損傷.從圖 5a可見,紫外線消毒對大腸桿菌的 434bp長度的核酸損傷不明顯,300mJ/cm2的紫外劑量仍有較明顯的DNA條帶.增加PCR檢測過程中16s rRNA片段長度到1450bp時,盡管整個檢測過程均能檢測到明顯的DNA條帶,值得注意的是隨紫外劑量的增加條帶亮度明顯減少(圖 5b),因此紫外線消毒導致了微生物16s rRNA的損傷,片段長度越長損傷越明顯,低片段長度由于捕獲的DNA發生的損傷機率較低,檢測結果不明顯.Trombert等[26]研究表明 REP-PCR能在分子水平上分析紫外線消毒對微生物的滅活以及暗修復機制.我們研究表明,盡管紫外線消毒能導致DNA的損傷,然而當紫外劑量達到＞80mJ/cm2時,微生物完全被滅活,DNA仍有明顯的條帶,因此采用PCR檢測DNA的損傷無法判斷微生物的失活狀態.

圖4 紫外線消毒對E. coli總ATP的影響Fig.4 Effect of UV disinfection on total ATP of E. coli

圖5 紫外線消毒后E. coli的DNA損傷Fig.5 DNA damage of E. coli after UV disinfection M, DL2000marker; 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300紫外劑量分別為0, 50, 100, 150, 200, 250, 300mJ/cm2

2.3.4 紫外線消毒對 RNA損傷 有研究表明RNA的半衰期較短,與DNA相比RNA更能反應細胞的活性.我們研究進一步對紫外線消毒前后RNA進行PCR擴增分析,并選用SOS基因修復相關的recA引物,從分子水平分析紫外線消毒過程可能存在的修復過程.如圖 6所示,相對 DNA而言,紫外線消毒對 RNA的損傷更嚴重,隨紫外劑量增加,條帶亮度明顯減弱,當紫外劑量達到污水處理廠常用的 40mJ/cm2時,仍存在較弱的RNA條帶.聯系微生物的復蘇過程,隨紫外線劑量增加,暗修復能力明顯減弱,與該結果一致.盡管40mJ/cm2時光復活和暗修復百分比較低.然而PCR結果顯示40mJ/cm2仍有一定的損傷修復的能力,因此水處理過程中應考慮加大紫外劑量(＞40mJ/cm2),或采用紫外-氯聯用的方式來抑制復蘇現象.紫外-氯聯用方式能提供持續性消毒效果有利于控制復蘇現象[27],提高消毒效果[28].當紫外線劑量達到 50mJ/cm2時,RNA擴增條帶完全消失,失去了 SOS損傷修復能力,因此高劑量的80mJ/cm2時,大腸桿菌的復蘇幾乎為零.

圖6 紫外線消毒后E. coli的RNA損傷Fig.6 RNA damage of E. coli after UV disinfection M, 100bp DNA ladder; 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50紫外劑量分別為0, 5, 10, 20, 30, 40, 50mJ/cm2; N, 空白對照

2.4 紫外線消毒損傷機制和復蘇能力的對比分析

紫外線消毒過程中對細胞膜的損傷能力微乎其微,保證了細胞的完整性,為復蘇過程提供保障;此外對總ATP含量的影響較小,微生物進入了亞致死狀態或處于活性但非可培養的狀態(VBNC),微生物仍存在一定的代謝活性,為復蘇過程提供一定 ATP;盡管紫外線消毒引起一定的DNA損傷,導致嘧啶二聚體(CPD)和6-4光產物的形成,經過相關的修復機制,能導致微生物的復蘇;然而隨紫外線劑量的增加,大腸桿菌的 RNA損傷越來越嚴重,與修復相關的途徑受到嚴重的破壞,高劑量下的大腸桿菌復蘇能力明顯減弱,且大腸桿菌完全被滅活,因此recA相關的RNA的消失可用于指示微生物發生了不可逆的損傷.

3 結論

3.1 80mJ/cm2紫外線劑量下,大腸桿菌的去除率6.25-log,幾乎完全被滅活. 經20mJ/cm2紫外線輻射后 24h,大腸桿菌的復活百分比和暗修復百分比分別達到 0.018%和 0.00042%,光復活能力明顯大于暗修復能力.經80mJ/cm2紫外線輻射后 24h,大腸桿菌的光復活和暗修復百分比明顯降低,僅為0.0059%和0.000009%.

3.2 紫外線消毒過程 DNA的降解過程取決于片段長度,1450bp的 16s rRNA的基因損傷較434bp的16s rRNA的基因損傷更明顯,水處理常規的紫外線消毒劑量(＜100mJ/cm2),對總 ATP含量和細胞膜的損傷作用很小.

3.3 紫外線消毒對大腸桿菌的 RNA損傷較嚴重,紫外線劑量達到50mJ/cm2時,失去了SOS損傷修復的能力,因此80mJ/cm2大腸桿菌的復蘇能力較弱,recA相關的RNA的消失可用于指示微生物發生了不可逆的損傷.

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Studies on the injury and reactivation of Escherichia coli under ultraviolet disinfection.

XU Li-mei, XU Peng-cheng, ZHANG Chong-miao*, WANG Xiao-chang**(Key Laboratory of Northwest Water Resource, Environment and Ecology, Department of Environmental and Municipal Engineering, Xi’an University of Architecture and Technology, Xi’an 710055, China). China Environmental Science, 2017,37(7)：2639～2645

In this study, the photoreactivation and dark repair of Escherichia coli (E. coli) was investigated. The effects of ultraviolet (UV) disinfection on membrane integrity, adenosine triphosphate (ATP) and nucleic acid (DNA, RNA) were further analyzed. The aim of our study was to explore the response pattern of E. coli to UV disinfection by combination of SOS response mechanism of recA gene. The results showed that the inactivation efficiency of E. coli reached 5.63-log at a UV dose of 20mJ/cm2. When the light exposure time and dark repair time was prolonged to 24h after a UV dose of 20mJ/cm2, the percentages of photoreactivation and dark repair observed for E. coli were 0.018% and 0.00042%, respectively. The ability of photoreactivation of E. coli was higher than that of dark repair. The DNA damage depended on the fragment length of genes during UV disinfection. The longer the 16s rRNA gene was, the more seriously damage occurred. Conventional UV doses in wastewater treatment did not affect the amount of total ATP and membrane integrity, which provided basic guarantee for the reactivation of E. coli after UV disinfection. UV disinfection caused serious damage in recA RNA. When UV dose reached 50mJ/cm2, E. coli lost the SOS response mechanism. Hence, little reactivation was observed using the culture method at a UV dose of 80mJ/cm2. The lost of recA RNA could be used as an indicator for the occurrence of the irreversible injury to microorganism.

UV；reactivation；membrane integrity；ATP；DNA；RNA

X52,X505

A

1000-6923(2017)07-2639-07

徐麗梅(1987-),女,山東威海人,博士,主要研究方向為水中病原微生物的控制.發表論文4篇.

2016-11-15

國家自然科學基金資助項目(51578441);陜西省教育廳科研計劃項目(15JK1442);國家水體污染控制與治理科技重大專項(2013ZX07310-001);陜西省污水處理與資源化重點科技創新團隊項目(2013KCT-13)

* 責任作者, 教授, zhangchongmiao@163.com; ** 責任作者, 教授, xcwang@xauat.edu.cn