PCR-DGGE分析不同品牌腐乳中細菌的多樣性

陳穎慧

(永城職業學院 食品化工系，河南 永城 476600)

PCR-DGGE分析不同品牌腐乳中細菌的多樣性

陳穎慧

(永城職業學院 食品化工系，河南 永城 476600)

以不同品牌腐乳為研究對象，利用聚合酶鏈式反應的變性梯度凝膠電泳技術對腐乳中的細菌進行多樣性分析。結果表明：克東牌腐乳的細菌多樣性最低，廣合牌腐乳的細菌多樣性最高。乳酸桿菌屬是腐乳中細菌的優勢菌群。乳酸菌屬、藤黃微球菌和糞腸球菌為4種品牌腐乳的共有菌株。融合魏斯氏菌、瑞士乳桿菌和乳酸鏈球菌存在于老才臣牌腐乳、廣合牌腐乳和王致和牌腐乳中。植物乳桿菌和發酵乳桿菌存在于廣合牌腐乳和王致和牌腐乳中。玫瑰考克氏菌只存在于克東牌腐乳中，而醋酸鈣不動桿菌只存在于王致和牌腐乳中。可知不同品牌腐乳中細菌的多樣性存在著差異。

腐乳；細菌；多樣性；聚合酶鏈式反應的變性梯度凝膠電泳

腐乳，又被稱為豆腐乳，是我國重要的調味品之一，其風味鮮咸、口感軟滑、營養價值較高，深受我國消費者的喜愛[1,2]。在腐乳的發酵過程中細菌扮演了至關重要的角色，與腐乳的風味、口感和營養物質的變化密切相關，研究已經表明玫瑰耐鹽球菌、植物乳桿菌和藤黃微球菌等微生物在腐乳發酵過程中都發揮著重要作用[3-5]。市場上腐乳產品多種多樣，也會呈現出不同的風味，因此對不同品牌腐乳產品進行細菌多樣性分析十分必要。

目前，大多數的研究只停留在腐乳中微生物的分離和鑒定，但是傳統分離鑒定的方法不僅費時費力，而且容易受到培養條件的限制，很難達到分析樣品細菌多樣性的目的[6,7]。聚合酶鏈式反應的變性梯度凝膠電泳(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, PCR-DGGE)技術能夠不經過分離鑒定，通過樣品的DNA指紋圖譜反映多樣性情況，并結合基因測序技術對目的條帶進行鑒定，能夠滿足揭示乳酸菌多樣性的需要[8,9]。因此，本研究利用PCR-DGGE技術分析不同品牌腐乳中細菌群落特征的差異，為腐乳發酵劑的篩選提供參考，具有一定的應用價值。

1 材料與儀器

1.1 主要材料

1.1.1 樣品來源

4種不同品牌腐乳產品：分別為A(克東牌腐乳)，B(老才臣牌腐乳)，C(廣合牌腐乳)，D(王致和牌腐乳)，購買于沃爾瑪超市。

1.1.2 主要試劑

dNTP(2.5 mmol/L)、10×rTaq Buffer(含15 mmol/L MgCl2)、TaqDNA聚合酶、6×Loading Buffer、Marker I和雙蒸水 上海吉泰依科賽生物科技有限公司；TAE緩沖液、TE緩沖液、氯仿、冰乙酸、蛋白酶K、瓊脂糖、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和過硫酸銨 無錫藍波化學品有限公司；GeneFinder電泳核酸染料 北京金博益生物技術有限公司；引物Lac1和Lac2，40bp“GC” 蘇州金唯智生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器

YP102N電子天平 成都一科儀器設備有限公司；H2100R臺式高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；渦旋振蕩器 上海納茲儀器有限公司；JK-WB-2A數顯恒溫水浴鍋 上海精學科學儀器有限公司；EPS-300穩壓穩流電泳儀 上海天能科技有限公司；變性梯度凝膠電泳儀 美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 樣品DNA提取及PCR擴增

根據謝顯華等[10]的報道，對腐乳樣品中的總DNA進行提取。以提取的總DNA為模板，對腐乳中的細菌16S rRNA V3區進行擴增。所用的引物BA338f(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')，UN518r(5'-ATTACCGCGGCTGCTCC-3')，BA338f引物的5'端加一個40 bp“GC”夾，擴增條件為92 ℃預變性2 min，92 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環30次，最后76 ℃延伸6 min[11]。

2.2 DGGE分析

腐乳中細菌DGGE分析的變性凝膠梯度為30%～55%，將32 μL乳酸菌PCR特異產物與8 μL 6×Loading Buffer混合后進行上樣，加入TAE緩沖液并保持在60 ℃、電壓70 V、電泳18 h[12]。電泳結束后小心將DGGE膠體取下，并用去離子水沖洗2次，配制1%的GeneFinder的染色液，浸沒膠體，在搖床上避光染色30 min，最后利用UVP凝膠成像系統記錄結果，得到DGGE圖譜，并利用Shannon-Weaver指數分析腐乳中乳酸菌的多樣性，公式如下：

Shannon-Weaver=-∑Pilnpk=-∑(Ni/n)ln(Ni/N)。

式中：Pi為樣品中某一條帶強度在該樣品的所有條帶總強度所占的比例；Ni為第i個條帶的光密度；N為泳道中所有條帶的光密度值之和。

2.3 基因測序

選取DGGE圖譜不同位置的優勢條帶在紫外燈下進行切膠，將切下的凝膠轉移到PCR管中，利用無菌水對其進行沖洗，搗碎后放入TE緩沖液中，并在4 ℃冰箱中放置12 h。取上清液5 μL，對其進行PCR特異擴增，PCR產物送往蘇州金唯智生物科技有限公司進行基因測序。將測序結果進行Blast比對，從而完成菌株的鑒定。

3 結果與分析

3.1 不同品牌腐乳中細菌DNA-PCR擴增結果

利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對不同品牌腐乳中的細菌DNA擴增產物進行檢驗，結果見圖1。

圖1 不同品牌腐乳中細菌DNA的擴增產物

注：MI表示Marker I；A～D表示樣品編號。

由圖1可知，所有樣品的條帶大小在200 bp左右，條帶均一清晰，可認為是細菌的目的條帶。

3.2 不同品牌腐乳中乳酸菌的生物多樣性分析

利用DGGE電泳技術分析不同品牌腐乳中細菌的生物多樣性，結果見圖2。

圖2 不同品牌腐乳中細菌的DGGE圖譜

注：A～D表示樣品編號；1～13表示DGGE圖譜中不同位置條帶編號。

在此基礎上，根據DGGE圖譜中每個樣品的條帶數及Shannon-Weaver指數評估其多樣性，結果見圖3。

圖3 不同品牌腐乳中細菌的條帶數目及Shannon-Weaver指數

由圖2可知，4個來自不同品牌腐乳中細菌的DGGE圖譜中共有13個不同位置的條帶，且不同樣品的圖譜也存在著一定的差異。由圖3可知，4個樣品的DGGE條帶的個數分別為C(廣合牌腐乳，9條)>D(王致和牌腐乳，8條)>B(老才臣牌腐乳，7條)>A(克東牌腐乳，5條)。Shannon-Wiener指數是評價樣品生物多樣性的重要參數，且Shannon-Wiener指數越高說明樣品中微生物的種類越多，生物多樣性就越高。Shannon-Weaver指數結果表明(見圖3)：C中細菌的生物多樣性最高，而A中細菌的生物多樣性最低，可見4種不同品牌的腐乳樣品中細菌的生物多樣性存在一定的差異。

3.3 DGGE圖譜優勢條帶測序分析

將13個不同位置的條帶進行割膠、PCR擴增及基因測序，條帶編碼見圖2，測序結果見表1。

表1 DGGE圖譜中條帶Blast對比結果Table 1 Blast comparison results of brands in DGGE profiles

13個不同的條帶代表了10種不同的細菌，其中乳酸桿菌屬是腐乳中細菌的優勢屬。乳酸菌屬、藤黃微球菌和糞腸球菌在4種不同品牌的腐乳中均有發現。融合魏斯氏菌、瑞士乳桿菌和乳酸鏈球菌存在于B，C，D的樣品中。植物乳桿菌和發酵乳桿菌則存在于C和D中。玫瑰考克氏菌只存在于A樣品中，而醋酸鈣不動桿菌只存在于D樣品中，可見4種不同品牌的腐乳樣品中的細菌群落組成也存在著一定的差異。

4 結論

腐乳風味的形成主要取決于微生物的發酵，腐乳中細菌群落特征的差異是不同品牌風味不同的重要原因之一。在本研究中，4種品牌的腐乳中都含有乳酸桿菌屬、藤黃微球菌和糞腸球菌，其中乳酸桿菌屬是優勢菌群。同時，不同樣品中細菌多樣性也存在著一定的差異，C(廣合牌腐乳)中細菌的生物多樣性最高，而A(克東牌腐乳)中細菌的生物多樣性最低，此外4種不同品牌的腐乳樣品中的細菌群落組成也存在著差異。本研究的結果揭示不同品牌腐乳細菌多樣性的差異，為腐乳的工業生產及相關發酵劑的開發提供理論依據。

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[3]魯緋,張京生,劉子鵬,等.青方腐乳中乳酸菌的分離鑒定[J].食品與發酵工業,2006,32(4):38-41.

[4]陳曦.藤黃微球菌(Micrococcusluteus)KDF2及其胞外蛋白酶KRP2在腐乳中的應用研究[D].哈爾濱:東北農業大學,2014.

[5]李娟娟.玫瑰考克氏菌(Kocuriarosea)KDF3及其胞外蛋白酶KRP3在腐乳中的應用研究[D].哈爾濱: 東北農業大學,2014.

[6]費鵬.輪狀病毒腹瀉嬰兒腸道微生態變化的研究[D].哈爾濱:東北農業大學,2013.

[7]Fei P,Li L,Cai X,et al.Differences in the biodiversity of the fecal microbiota of infants with rotaviral diarrhea and healthy infants[J].Jundishapur Journal of Microbiology,2016,9(4):32-36.

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[12]張巧云,孟祥晨.幾種發酵豆醬的微生物組成及理化性質分析[J].食品科技,2013(8):266-270.

Bacterial Diversity Analysis of Fermented Bean Curd with Different Brands

CHEN Ying-hui

(Department of Food and Chemical Engineering, Yongcheng Vocational College, Yongcheng 476600,China)

Fermented bean curd with different brands is as the research object in this study. The bacterial diversity of samples is analyzed using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) technology. The results show that the bacterial diversity of Kedong fermented bean curd is the lowest, in the meanwhile, the bacterial diversity of Guanghe fermented bean curd is the highest.Lactobacillusspp. is the dominant bacterial community.Lactobacillusspp.,MicrococcusluteusandEnterococcusfaecalisare found in all samples.Weissellaconfusa,L.helveticusandStreptococcuslactisare presented in Laocaichen, Guanghe and Wangzhihe fermented bean curd.L.plantarumandL.fermentumare identified in Guanghe and Wangzhihe fermented bean curd.Kocuriaroseais only found in Kedong fermented bean curd.Acinetobactercalcoaceticusis only identified in Wangzhihe fermented bean curd. Conclusively, there are some differences in bacterial diversity among fermented bean curd with different brands.

fermented bean curd；bacteria；diversity；polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE)

2017-02-01

陳穎慧(1981-)，女，吉林白城人，講師，碩士，研究方向：食品科學與工程。

TS214.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.007

1000-9973(2017)07-0029-04