SPME-GC-MS法分析不同菌種比例混合發酵對酸乳風味的影響

（內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，呼和浩特010018）

SPME-GC-MS法分析不同菌種比例混合發酵對酸乳風味的影響

靳汝霖，武士美，任為一，丹彤，孫天松

（內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，呼和浩特010018）

∶探討了不同比例德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌混合發酵對發酵乳風味的影響。以三種不同比例（1∶10，1∶100，1∶1000）的德氏乳桿菌保加利亞亞種IMAU20240和嗜熱鏈球菌IMAU40040的混合發酵乳為研究對象，采用固相微萃取與氣相色譜-質譜聯用技術（SPME-GC-MS），并結合內標法對各復配發酵乳中的揮發性風味物質進行分析測定。結果表明，三種比例的復配組發酵乳中主要揮發性風味物質是由酸類、醇類、酮類、醛類以及酯類等化合物組成，且各復配組發酵乳在貯藏期間主要揮發性風味化合物的種類和數量存在明顯差異，其中1∶100復配組的發酵乳中主要揮發性風味化合物有乙酸、乙偶姻、乙醛、己醇、甲酸乙烯酯及3-甲基-1-丁醇等，且含量高于其他復配組，是理想的組合。

∶發酵乳；揮發性風味物質；固相微萃取（SPME）；氣相色譜-質譜法（GC-MS）

0 引言

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）協同發酵牛乳，可產生少量副產物，并形成發酵乳的風味物質[1-2]，其中，揮發性風味物質對發酵乳風味的形成具有決定性作用[3]。已報道的有關發酵乳中揮發性風味物質的研究中，只將少數含量很高的幾種化合物作為主要的風味物質，如Gallardo-Escamilla等[4]在分析發酵乳清液的風味時，發現其主要特征風味物質有乙醛、雙乙酰、乙偶姻、乙酸等；王偉君等[5]在嗜熱鏈球菌發酵乳中共鑒定出13種相關風味成分，其中主要風味物質有2，3-丁二酮、2，3-戊二酮等。本研究將德氏乳桿菌保加利亞亞種IMAU20240和嗜熱鏈球菌IMAU40040分別以1∶10、1∶100和1∶1000的比例進行復配發酵，采用固相微萃取與氣相色譜-質譜聯用技術（SPME-GC-MS），并結合內標法對其進行定性和定量分析。通過分析三個復配組發酵乳風味的構成及特點，旨在改善發酵乳的風味品質，為乳酸菌發酵劑的篩選及應用提供理論依據。

1 實驗

1.1 菌株

本實驗所用的發酵菌株嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）IMAU40040（Genbank號∶FJ749316）和德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bul?garicus）IMAU20240（Genbank號∶HM057974）由內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供。

1.2 材料與培養基

全脂乳粉，MRS液體培養基，M17液體培養基，C3～C20正構烷烴（色譜純），1，2-二氯苯（標準品）。

1.3 儀器設備

雷磁pH計，氣相色譜-質譜聯用儀（Agilent 7890B GC system-5977A MSD），色譜柱為HP-5毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），手動固相微萃取（SPME）進樣手柄，萃取頭（65 μm PDMS/DVB）。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化和菌懸液的制備

將菌種保藏管中的嗜熱鏈球菌IMAU40040和德氏乳桿菌保加利亞亞種IMAU20240分別在脫脂乳培養基（10%脫脂乳，0.1%酵母粉）中活化，再分別轉接于M17和MRS液體培養基活化三代，使菌株活力達到最大。將菌株分別于50，100 mL和200 mL的MRS液體培養基中連續擴大培養，經轉速為4 000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，用滅菌的PBS緩沖液洗滌去除培養基成分，置于PBS保護液，制得菌懸液于4℃保存，12 h內使用。

1.4.2 發酵乳制備

將蒸餾水預熱至50℃加入11.5%的全脂乳粉混勻，待溫度上升至60℃，加入質量分數為6.5%蔗糖，水和30 min后均質（低壓15 MPa，高壓35 MPa），接著90～95℃殺菌5～10 min，待冷卻至42℃，接種并分裝于樣品瓶恒溫發酵至pH值小于4.5且酸度大于70°T（發酵終點），轉移至4℃貯藏12 h。

接種∶將5×106g-1的德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌按1∶10，1∶100，1∶1000的比例接入滅菌后的全脂乳（非脂乳固體質量分數為13.87%，脂肪質量分數為3.08%）中。發酵完畢的發酵乳于4℃貯藏12 h后取樣，-20℃保藏。

1.4.3 樣品前處理

樣品中加入0.05 mL 1，2-二氯苯（最終質量濃度約為0.01 ppm）作為內標物，然后將老化后的萃取頭通過密封墊插入樣品瓶，頂空吸附60 min。每個比例樣品各取3個平行。

1.4.4 揮發性風味物質的測定

色譜條件∶起始溫度40℃，保持3 min，以4℃/min升溫速率升至140℃，保持1 min，以10℃/min升溫到250℃，保持3 min；汽化室溫度為250℃；載氣為He，流速1.0 mL/min；不分流進樣。

質譜條件∶EI離子源，電子能量70 eV；離子源溫度230℃；質量掃描范圍（m/z）33～450 AMU；發射電流100 μA。

萃取條件∶平衡溫度為50℃，平衡時間為60 min。

解吸附條件∶250℃條件下解吸附3 min。

1.4.5 定性與定量分析

利用隨機攜帶Masshunter工作站NIST 1.1標準庫自動檢索各組分質譜數據結果，采用以上相同的程序升溫條件，用C3～C20正構烷烴作為標準，根據保留時間計算樣品中檢測的化合物的保留指數（reten?tion index，RI），同時結合相似度并參考相關文獻色譜保留指數[6-9]共同定性，確定出相應的揮發性風味物質種類。采用各成分峰面積與內標物峰面積對比進行半定量分析，計算公式為

2 結果與分析

應用SPME-GC-MS法分析不同比例（1∶10、1∶100和1∶1000）保加利亞乳桿菌IMAU20240和嗜熱鏈球菌IMAU40040的復配發酵乳中揮發性風味物質，在貯藏12 h時的分離情況見圖1，測定結果如表1～表5所示。

圖1 貯藏12 h時揮發性風味化合物的總離子圖

2.1 酸類化合物的比較分析

酸類化合物一般是通過脂肪分解和微生物發酵產生的[3]。由表1可知，貯藏12 h時三種比例復配組的發酵乳中檢出的酸類化合物的種類和含量出現顯著差異。3種比例復配組的發酵乳中檢出的共有的酸類化合物有4種，分別為戊酸、3-甲基丁酸、己酸、辛酸，且各復配組中各組分含量有明顯差異，其中，1∶100復配組中各組分含量高于其他復配組，分別為4.57，174.37，18.39，12.95（×10-6）。除上述共有化合物外，各復配組發酵乳中還檢出一些獨有成分，如1∶10復配組發酵乳中檢出丙基丙二酸、2-甲基己酸，1∶100復配組發酵乳中檢出丁酸、n-癸酸，1∶1000復配組發酵乳中檢出2-甲基丙酸。通過分析3組復配組發酵乳中的風味物質，發現1∶100復配組發酵乳中檢出的酸類化合物的種類和含量明顯高于其他復配組，如乙酸、己酸的含量分別為20.24、18.39 ppm，遠高壬酮，且含量較低。一些研究者認為2，3-丁二酮是發酵乳風味形成的關鍵成分[15]，可以賦予發酵乳濃郁的奶油香味[16]。本實驗在貯藏12 h時三個復配組均未檢出2，3-丁二酮，這可能由于2，3-丁二酮在3-羥基-2-丁酮還原酶的作用下發生不可逆反應代謝為3-羥基-2-丁酮（乙偶姻）。乙偶姻是許多乳制品中常見的風味物質，能賦予發酵乳弱奶油香味[3]。由表2可以看出，在貯藏12 h時三個復配組發酵乳中均檢出于其他比例的復配組。乙酸、己酸等揮發性酸能增加發酵乳的酸味[10]，在其他研究中也發現了類似的結果[11]。綜上所述，當保加利亞乳桿菌IMAU20240和嗜熱鏈球菌IMAU40040的添加比例為1∶100時，發酵乳中檢出的酸類化合物的種類和含量顯著優于其他比例的復配組。

表1 貯藏期間酸類化合物的鑒定結果

2.2 酮類化合物的比較分析

酮類化合物主要是由不飽和脂肪酸的氧化或熱降解、氨基酸降解或微生物代謝所產生[12-13]。本實驗在貯藏12 h時三個復配組共檢出7種酮類物質，包括3-甲基-2-丁酮、乙偶姻、2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮、5-甲基-3-庚酮及2-十一酮。這些化合物均在復配組1∶10和1∶100中被檢出，而在復配組1∶1000的發酵乳中只檢測出3-甲基-2-丁酮、乙偶姻、2-戊酮、2-乙偶姻，且1∶100復配組中其含量為74.33×10-6，明顯高于其他復配組。此外，由辛酸的β氧化和癸酸的脫羧反應得到的2-庚酮、2-壬酮兩個甲基酮[17]均在復配組1∶10和1∶100中檢出，而在復配組1∶1000的發酵乳中只檢出2-壬酮，這些化合物可賦予發酵乳水果味、奶香味，對發酵乳風味的構成具有重要意義[4]。針對不同比例復配組發酵乳風味差異性的研究發現，復配組1∶100發酵乳中的酮類化合物的種類和含量顯著高于其他比例的復配組。

2.3 醇類化合物的比較分析

醇類化合物一般是由脂肪酸衍生而來或羰基化合物還原而來[18-19]。由表3可知，貯藏12 h時從三個比例的復配組發酵乳中共檢出12種醇類化合物，且各復配組中醇類化合物的種類和含量明顯不同。其中，復配組1∶10、1∶100、1∶1000發酵乳中分別檢出10、8、3種醇類化合物。在上述不同比例復配發酵乳中檢出

的共有醇類化合物有3-甲基-1-丁醇、1-庚醇和1-辛醇，且各復配組中的含量出現明顯差異。其中，復配組1∶100發酵乳中共有醇類化合物的含量遠高于其他復配組，分別為13.49，17.17，14.43（×10-6）。除上述共有醇類化合物外，各復配組發酵乳中還檢出一些獨有成分，如1∶10復配組發酵乳中檢出4-甲基環己醇、反-1，2-環戊二醇、反式-2-辛烯-1-醇、2，7-二甲基正辛醇，1∶100復配組發酵乳中檢出3-甲基甲酸丁醇，1-己醇，而在1∶1000復配組發酵乳中沒有檢出獨有化合物。大多醇類化合物的風味閾值較高，因此認為這類化合物對發酵乳的風味影響貢獻不大[20]。

表2 貯藏期間酮類化合物的鑒定結果

表3 貯藏期間醇類化合物的鑒定結果

2.4 醛類化合物的比較分析

醛類化合物的閾值較低，對發酵乳風味的形成貢獻較大[21]。本實驗中檢出7種醛類化合物，其中1∶1000復配組發酵乳中僅檢出3-甲基丁醛和3-羥基丁醛，而這兩種物質在復配組1∶100和1∶10發酵乳中均有檢出，且復配組1∶100發酵乳中含量相對較高。此外，復配組1∶10和1∶100的發酵乳中還檢出其他多種醛類化合物，包括乙醛、庚醛、反-2-辛烯醛、己醛及2-甲基丙醛等。其中，乙醛是發酵乳中重要的風味化合物[22]，純乙醛具有辛辣刺激性的氣味，但適量濃度的乙醛不僅能平衡發酵乳風味而且能賦予產品良好的風味[23]。一般認為具有典型風味發酵乳中乙醛含量為10～15×10-6，而高品質發酵乳中的乙醛含量要高于31.27×10-6。由表4中可以看出，貯藏12 h時，復配組1∶10、1∶100發酵乳中檢出的乙醛含量分別為6.83和34.56×10-6ppm，而在1∶1000復配發酵乳中沒有檢測到乙醛，說明復配組1∶100發酵乳的風味要優于其他復配組。除乙醛外，其他醛類化合物的存在也對發酵乳的風味產生影響，如己醛作為亞油酸的主要氧化產物[24]，可對發酵乳整體風味產生重要影響[25]。

2.5 酯類化合物的比較分析

發酵乳中的酯類物質大多是分子量較小的酸類物質和醇類物質發生酯化反應或環化反應生成的低級脂肪酸化酯及內酯[26]。大多數的酯類化合物的閾值較低，具有果香味或堅果仁味，可以降低脂肪酸和胺類物質帶來的苦澀味[27]。本實驗在貯藏12 h時共檢出4種酯類物質，包括甲酸乙烯酯、硝酸正戊酯、乙酰乙酸壬酯及2-乙基丁酸烯丙酯，其中甲酸乙烯酯在三個復配組（1∶10、1∶100、1∶1000）發酵乳中均有檢出，其含量分別為7.90、39.14和28.14×10-6。其余酯類化合物只在復配組1∶10發酵乳中被檢出，且含量較低，對發酵乳的整體風味影響較低。

表4 貯藏期間醛類化合物的鑒定結果

表5 貯藏期間酯類化合物的鑒定結果

3 結論

本實驗將保加利亞乳桿菌IMAU20240和嗜熱鏈球菌IMAU40040以不同比例（1∶10，1∶100和1∶1000）復配，采用1，2-二氯苯作為內標，利用固相微萃取前處理方法，結合氣相色譜-質譜聯用技術分析發酵乳中揮發性風味物質。結果表明，各比例復配組發酵乳中的揮發性風味物主要由酸類、醇類、酮類、醛類以及酯類等化合物組成；且三個復配組發酵乳在貯藏期間主要的揮發性風味化合物的種類和含量存在明顯差異，其中，復配組1∶100的發酵乳中主要的揮發性風味化合物有乙酸、乙偶姻、乙醛、己醇、甲酸乙烯酯及3-甲基-1-丁醇等，且含量高于其他復配組發酵乳，說明保加利亞乳桿菌IMAU20240和嗜熱鏈球菌IMAU40040活菌數的比例為1∶100時，其發酵乳的風味優于其他組合。

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Analysis of fermented milk flavor in mixed fermentation of different strains with various proportions by SPME-GC-MS

JIN Rulin，WU Shimei，REN Weiyi，DAN Tong，SUN Tiansong
（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering，Ministry of Education，Inner Mongolia Agricultural Universi?ty，Hohhot 010018，China）

∶The effects ofLactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricusandStreptococcus thermophiluswith different proportions on the fer?mented milk flavor were studied.The volatile flavor compounds of fermented milkby starters ofLactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus IMAU20240 andStreptococcus thermophilusIMAU40040 in three different ratios（1∶10，1∶100 and 1∶1000）were detected using solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry（SPME-GC-MS）technique，and internal standard method.The results showed that the main volatile flavor compounds in all of fermented milk groups were composed by acids，alcohols，ketones，aldehydes and es?ters.But the types and quantities of main flavor compounds were significantly different during storage.Among them，the fermented milk group in a ratio of 1∶100 had acetic acid，acetoin，acetaldehyde，hexyl alcohol，vinyl formate and 3-methyl-1-butanol and their content were higher than the other groups，so two strains in the ratios 1∶100 was considered as the ideal combination.

∶fermented milk；volatile flavor compounds；solid phase microextraction（SPME）；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

Q93-33

：A

：1001-2230（2017）06-0009-06

2016-12-10

國家自然科學基金項目（31471711；31460446）。

靳汝霖（1992-），女，碩士研究生，研究方向為乳品生物技術與工程。

孫天松