西藏牦牛奶渣優良乳酸菌篩選及混合發酵優化

萬金敏，葛武鵬，楊麗娜，王西寧，梁秀珍，王智，秦立虎

（1.西北農林科技大學食品學院，陜西楊凌712100；2.楊凌示范區醫院，陜西楊凌712100；3.陜西飛天乳業有限公司，陜西寶雞721100；4.陜西百躍優利士乳業有限公司，陜西咸陽712000；5.陜西西安市奶牛育種中心，西安710000）

西藏牦牛奶渣優良乳酸菌篩選及混合發酵優化

萬金敏1，葛武鵬1，楊麗娜1，王西寧2，梁秀珍3，王智4，秦立虎5

（1.西北農林科技大學食品學院，陜西楊凌712100；2.楊凌示范區醫院，陜西楊凌712100；3.陜西飛天乳業有限公司，陜西寶雞721100；4.陜西百躍優利士乳業有限公司，陜西咸陽712000；5.陜西西安市奶牛育種中心，西安710000）

對從西藏牦牛奶渣中分離出的113株乳酸菌，以牛乳為基質經遺傳穩定性、凝乳時間、凝乳酸度、后發酵酸度及組織狀態等指標綜合評價篩選出5株優良乳酸菌，得到4株乳酸桿菌(B、C、D、E)和1株乳球菌(A)。將4株桿菌與球菌復配，進行組合發酵優化試驗。通過發酵乳增菌規律、產酸性能、pH值、產香能力等綜合指標加權比較，確定最優組合，為工業化應用提供參考。結果表明：①5株優勢菌單株發酵凝乳時間均在4～6 h之間，凝乳酸度在62.57～70.40°T之間，后發酵酸度在96.24～109.20°T；②以活菌數增菌性能和產酸性能為指標進行組合優化，顯示AB和AC具有共生關系，在脫脂牛乳中37℃發酵8 h，AB組合活菌數最高，達6.46×109mL-1，AC組合酸度最高，達91.87°T。AB、AC組合發酵性能均優于各單菌株，差異顯著（P＜0.05），而AD和AE組合與各單菌株間發酵性能無顯著性差異（P＞0.05）。③最優菌種組合為AB（1∶1）復配，凝乳時活菌數為4.57×109mL-1，凝乳酸度為71.54°T，后發酵酸度為115.30°T，發酵乳產品中乙醛質量濃度為36.91 μg/mL、丁二酮質量濃度為13.82 μg/mL，產品質構良好。

牦牛奶渣；乳酸菌；發酵乳；組合發酵

0 引言

自乳酸菌發現以來，研究人員對其代謝途徑、發酵性能等方面進行了廣泛的研究[1]。西藏高原牧區海拔高，平均氣溫低，晝夜溫差大，紫外輻射強，這些地區傳統乳制品中的乳酸菌適應了這一惡劣環境大量存活并繁衍下來，保存了其生物學特性[2]。發酵乳質量的好壞取決于發酵劑的品質、類型及活力[3]。目前我國發酵劑菌種來源多由國外著名菌種供應商主導，因此，從西藏牦牛奶渣中篩選出優良乳酸菌進行組合發酵，開發具有良好發酵性能的復合發酵劑，具有潛在應用價值[4]。

本研究對從奶渣中分離出的113株乳酸菌依據凝乳時間、凝乳酸度、后發酵酸度及發酵乳質構特性篩選得到5株優勢乳酸菌，并對其進行組合優化發酵試驗，為開發復合發酵劑提供技術依據。

1 實驗

1.1 菌種與試劑

113株乳酸菌菌株分離自西藏拉薩市、當雄市、林芝米拉山地區和浪卡子地區的10份樣品中。

鮮牛乳由西北農林科技大學畜牧站提供；脫脂乳粉（用于菌種活化）；氫氧化鈉、三氯乙酸（TCA）、四硼酸鈉、絲氨酸、鄰苯二甲醛、酚酞、碘、體積分數為95%乙醇、HCl、丁二酮（標品）、硫酸鐵銨等試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

電熱恒溫培養箱DRP-9162型；紫外分光光度計UV-2802型；數顯pH計PHSJ-3F型；分析天平FC104型；高速離心機HC3018型；立式蒸汽滅菌器YXQ-LS-50S11型；雙人單面超凈臺SW-CJ-2D型。

1.3 方法

1.3.1 單個菌株的篩選

（1）菌株遺傳穩定性的測定。將乳酸菌接種到MRS液體培養基中培養24 h后，按照3%比例接種于滅菌脫脂乳中37℃發酵，凝乳時記錄凝乳時間。然后將其放入4℃冰箱中后發酵24 h，觀察凝乳外觀、組織狀態及乳清晰出等，然后按3%繼續接種培養，連續傳代20次，淘汰活性差、凝乳質量不穩定的菌株，選擇凝乳狀態好且遺傳性能穩定的菌株。

（2）凝乳時間。將各菌株活化后，以3%的比例接種于滅菌脫脂乳中，置37℃恒溫培養箱中發酵，記錄凝乳時間。平行3次試驗。

（3）凝乳酸度的測定。根據GB 5413.34-2010酸度測定方法，按菌種3%比例接種到12%滅菌脫脂乳中，37℃發酵，用0.1 mol/L的NaOH標準溶液滴定測定，重復3次，其酸度以吉爾涅爾度(°T)[5]。

（4）后發酵酸度的測定。將各菌株對應的發酵劑以3%的比例接種于滅菌脫脂乳中，置37℃恒溫培養箱中發酵，待凝固后立即轉入4℃冰箱冷藏24 h后，測定滴定酸度。測定方法參考：GB/T 5413.34-2010《乳和乳制品酸度的測定》。

（5）酸乳組織狀態。脫脂乳凝固后，分別就色澤、組織狀態等進行觀察記錄。

1.3.2 菌株組合發酵的研究

1.3.2.1 復合菌株產酸能力測定

將活化好的單菌株及按1∶1的比例混合好的菌種分別按3%接種量接種至滅菌脫脂乳培養基，于37℃恒溫培養箱培養，每隔1 h取三個平行樣品測定活菌數、pH值、滴定酸度，連續測定8 h，并作8 h內的生長變化規律表和產酸性能圖。通過試驗篩選出有協同作用的菌株組合。

1.3.2.2 復合菌株比例的篩選

將上述具有協同作用的桿菌與球菌分別按照1∶1，1∶2，1∶3，2∶1及3∶1的比例制作發酵劑，接種于滅菌脫脂乳中，凝乳后，記錄其凝乳時間，并測定凝乳酸度，置于4℃冰箱中，后發酵24 h后，測定其活菌數、后發酵滴定酸度、乙醛及丁二酮值，并進行感官評分。同時跟4株單菌株及普通酸奶發酵劑（嗜熱鏈球菌：保加利亞乳桿菌(YC)=1∶1）制作的發酵乳各指標進行對比。通過將活菌數、凝乳酸度、后酸化滴定酸度、乙醛、丁二酮進行加權計分，從而篩選出綜合指標最優的比例組合，同時跟感官評分進行比較和驗證。

1.3.2.3 活菌數測定

根據GB4789.35-2010《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》方法進行測定[6]。

1.3.2.4 乙醛含量測定

取適量試樣，與16%TCA等體積混勻，3 500 r/min離心10 min，取上清液25 mL于碘量瓶中，加入1% NaHSO3溶液5 mL，搖勻，暗處放置1 h。加入1%淀粉溶液1 mL，用0.1 mol/L碘液滴定至接近無色，再改用0.01 mol/L碘溶液滴定淡藍色出現。再加入1 mol/L的NaHCO3溶液20 mL，振蕩混勻，用0.01 mol/L碘標準溶液滴定至淡藍色再次出現，記錄消耗的碘液的體積[10]。同時做空白實驗，平行3次。

乙醛含量計算公式

乙醛(g/mL)=﹝(V1—V2)C×0.022﹞/25

V2為空白滴定消耗I2標準溶液的體積(mL)；V1為樣品滴定消耗I2標準溶液的體積(mL)；C為I2標準溶液的濃度(mol/L)；25為乙醛樣品稱樣量(mL)；0.022為乙醛化學反應基本單位(g)。

1.3.2.5 丁二酮含量測定

取待測乳樣，加等體積16%TCA溶液，混勻，3 500 r/min離心10 min，取上清液5mL，分別加入0.25 mL 1 g/100 mL的鄰苯二胺溶液，搖勻后置于黑暗處放于30 min，然后加入1.0 mL 4.0 mol/L HCl溶液以終止反應，混勻后在335 nm波長處用石英比色皿測定吸光度。每個樣品做3次平行。然后查丁二酮標準曲線可獲得待測樣品中丁二酮質量濃度[7-8]。

標準曲線制作：配制不同質量濃度的丁二酮標準液，然后按照樣品上述方法操作，在335 nm波長處測得各標準液的吸光度，平行測定3次。以丁二酮質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，如圖1所示。

圖1 標準曲線-丁二酮質量濃度與吸光值關系

1.3.2.6 感官評分

主要評估發酵乳產品的風味和質地特征，待乳酸菌發酵的全脂乳凝固后，放入冰箱4℃冷藏24 h后發酵，成品由12人小組進行感官評價，感官評分表參照POURAHMAD R和孫福春[9-10]。

表1 篩選結果

2 結果與分析

2.1 單菌株篩選結果

對分離自西藏牦牛奶渣的113株乳酸菌分別轉接20次以后，確定其發酵遺傳穩定性，剔除不穩定菌株后，以凝乳時間、凝乳酸度、后酸化酸度及其組織狀態為指標，篩選出了5株發酵性能良好的優勢菌株，分別是GY-L109、GY-L003、GY-L004、GY-L055、GY-L112，見表1。

在凝乳過程中，凝乳時間太短或太長，都對發酵乳的品質有一定影響。凝乳時間太短，不利于風味物質的形成，且對發酵乳質構特性也會產生不良的影響；凝乳時間過長，雖然對狀態和香味有一定的促進作用，但增大了發酵過程染菌幾率，且生產效率下降，不利于節約能源和時間[11]。因此本研究中選取凝乳時間3～6 h的乳酸菌作為初篩標準。

乳酸菌的產酸性能直接關系到發酵乳質量，菌株的產酸特性是篩選菌種的重要指標之一[12]。一般發酵乳國標要求的酸度為70～110°T，本試驗優選的5個菌株凝乳酸度均在62～71°T之間，基本符合酸度要求，且在實際生產中一般采用兩種及兩種以上的菌株復合發酵，可以彌補單菌株產酸不足的缺陷[13]。4℃冷藏24 h完成了后發酵階段，滴定酸度會明顯增加，波動范圍在96～110°T之間。各單株制成的發酵乳成品質構可接受，狀態基本細膩，風味可接受，基本無乳清晰出，表明該5株乳酸菌初步具備制作生產發酵劑的潛力。

2.2 優化發酵篩查優勢組合

5株優勢菌株A為乳酸球菌，B、C、D、E均為乳酸桿菌，按照球菌、桿菌互補原則將球桿菌分別以1∶1比例進行組合，組成了AB、AC、AD及AE復配組合，制作復合發酵劑，以單菌株發酵為參比，按接種量3%接于滅菌后的脫脂乳中，37℃下發酵，定時測定8h內的活菌數、pH及滴定酸度等參數，以活菌數增菌特性和產酸特性評價優化效果。

2.2.1 單菌株和復合菌株增菌變化情況

由表2可以看出，單株菌與1∶1復合株隨著發酵時間延長各菌株的生長趨勢高度一致，0～4 h內增菌快速，5～8 h增菌趨勢變緩。其中，單株A活菌數最高，8 h后達4.79×109mL-1，其余各單株8 h發酵活菌數均達109數量級。AB組合活菌數均高于各自單株(P＜0.05)，8 h達6.46×109mL-1。0～3 h，AC組合活菌數與各自單株接近(P＞0.05)，而在4～8 h間組合優勢顯現，活菌數明顯高于各自單株。而AD和AE組合未顯現出復配優勢，無共生關系。

2.2.2 單菌株和復合菌株產酸性能比較

乳酸菌的產酸性能是篩選發酵乳發酵劑的關鍵指標。每株乳酸菌產酸能力不盡相同。發酵過程中，單株和復合株的pH和滴定酸度的變化趨勢基本一致。圖2、3、4、5顯示了兩兩組合與各自單株發酵過程中的酸度和pH變化情況，其中，以AB、AC組合較為理想，AB組合滴定酸度始終顯著高于各自單株A和B(P＜0.05)，8 h時達到最高91.34°T。pH變化在初期發酵的2 h內組合與單株基本一致，2 h后AB組合明顯優于各自單株，最低pH為4.14。AC組合4～5 h滴定酸度介于A和C之間，其余顯著高于A和C(P＜0.05)。最終為91.87°T。AC的pH下降速率顯著高于A和C(P＜0.05)。8 h時pH為4.11。表明AB、AC組合發酵性能良好，具有共生關系。AD組合滴定酸度始終顯著低于A和D(P＜0.05)，三組的pH值接近，差異不顯著(P＞0.05)。發酵初期，AE組合滴定酸度介于A和E之間，之后AE滴定酸度低于單菌株。pH下降速率顯著低于A和E(P＜0.05)。AD、AE組合未體現出復合共生關系。

表2 發酵過程中乳酸菌活菌數的生長變化

圖2 A和B及AB在發酵過程中pH值、滴定酸度的變化

圖3 A和C及AC在發酵過程中pH值、滴定酸度的變化

圖4 A和D及AD在發酵過程中pH值、滴定酸度的變化

圖5 A和E及AE在發酵過程中pH值、滴定酸度的變化

盡管許多微生物之間存在協同共生作用，但并非所有的菌株都會有共生關系，有些菌株之間可能還存在不同程度的拮抗作用。因此，菌種復配是應注意使各菌株間產生理想的共生效果而不是彼此競爭[14]。由表2和圖2-圖5看出，復合株AB和AC的活菌數相比于各單株約在3～4 h后有明顯增多的趨勢，且產酸能力亦均高于各單株，而復合株AD和AE的活菌數與單株的差異不顯著，且產酸能力弱于單菌株。藉此判定，A與B、C復合具有一定共生關系。

2.3 優勢組合復配比例研究

依據影響重要性綜合考量的各指標權重分配分別為活菌數0.2、凝乳酸度0.3、后發酵酸度0.3、乙醛0.1、丁二酮0.1，表3展示了各指標值、加權得分和感官評分結果。

由表3可以看出，活菌數、凝乳酸度、后發酵酸度、乙醛、丁二酮等各個指標單株及復合株間均存在不同差異。

乳酸菌活菌數是體現活性發酵乳保健功能的重要指標之一。其活菌數高低直接影響著發酵乳的品質和促健康效能。國標（GB19302-2010）中亦有嚴格規定，要求活菌型發酵乳活菌數大于106mL-1。因此，僅從活菌數看，以AB（1∶2）復配及AC（3∶1）復配，表現最優，分別可達6.61×109mL-1和6.03×109mL-1，AB（1∶1）、AC（1∶1）組合次之，但亦均達到了109數量級，它們之間無顯著性差異。

表3 不同菌株的發酵乳各項指標的測定結果及感官評分

凝乳酸度比較與活菌數之間的比較結果相近，優選的AB（1∶1）、AB（3∶1）和AC（1∶1）組合制成的發酵乳之間差異不顯著（P＞0.05），但均顯著高于其它復合株；后發酵酸度比較發現，復合菌AB（1∶1）和AC（1∶1）均顯著高于其他單株或復合株，其中AB（1∶1）復配的后發酵酸度最高，為115.30°T。

風味物質組成與含量是評價一種發酵乳優劣的另一重要指標，目前發酵乳制品中已鑒定出有90多種與風味有關的揮發性化合物[15]，典型的發酵乳風味主要來自于乳酸菌發酵過程中產生的乳酸和各種羰基化合物，其中乙醛和雙乙酰被認為是構成發酵乳風味的主要成分[16]。乙醛對發酵乳的風味影響最大，雙乙酰對發酵乳飽滿風味的形成有重要作用[17-18]。不同的研究結果顯示乙醛和丁二酮質量濃度及比例均有一定差異，復合AB（1∶1）及AC（1∶1）發酵乳之間的乙醛質量濃度顯著高于其他復合株，分別為36.91 μg/mL和34.81 μg/mL，AB（1∶2）次之，AC（2∶1）質量濃度最低，為23.71 μg/mL，復合株AB（1∶1）發酵乳的丁二酮質量濃度最高，為13.82 μg/mL，而復合株AB（1∶2）發酵乳的質量濃度最低為7.96 μg/mL。不難發現本研究復配組合AB（1:1）制成的發酵乳乙醛和丁二酮生成量處于較高水平，與秦虹等[19]用甘肅藏區自然發酵牦牛乳中的優良乳酸菌制作酸乳，產生的乙醛和雙乙酰質量濃度分別為11～42.68 μg/mL和2.91～13.18 μg/mL和尚玉琳等[20]用保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌組合發酵酸乳時，酸乳中乙醛質量濃度在17.5～25.3 μg/mL之間，雙乙酰質量濃度在2.0～3.7 μg/mL之間研究相比較，本研究復配的發酵劑AB產香性能更為優良。

表3中感官評分結果分析表明，以AB（1∶1）制作的發酵乳，評分最高，產品質構特性最優，具有發酵乳特有的滋味和氣味，酸甜適度，組織細膩均勻，無乳清析出。

綜合以上各項分析結果認為以AB（1∶1）組合最優，顯現出較好的發酵性能和產香能力，具有良好共生關系。

3 結論

（1）對113株牦牛奶渣中的乳酸菌，通過凝乳時間、滴定酸度及感官評價等綜合指標優選出5株優勢菌。其共性特征是凝乳時間在4～6 h之間；凝乳酸度在64.17～69.24°T之間。

（2）單菌株與復合株的增菌規律及產酸性能趨勢一致。在脫脂牛乳中37℃發酵8 h，單菌株A活菌數最高為4.79×109mL-1，復合株AB活菌數最高為6.46×109mL-1；AC組合凝乳酸度最高，達91.87°T。AB和AC組合增菌能力及產酸能力均優于各單菌株，差異顯著（P＜0.05），而AD和AE組合與各單菌株間發酵性能無顯著性差異（P＞0.05）。

（3）最優菌種組合為AB（1∶1），活菌數為4.57× 109mL-1，凝乳酸度為71.54°T，后發酵酸度為115.30°T；發酵乳產品中乙醛質量濃度為36.91 μg/mL，丁二酮質量濃度為13.82 μg/mL，滋氣味濃郁飽滿，酸甜適度，組織細膩，無乳清析出。

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Screening of Lactic acid bacteria by high fermentation performance from yak milk dreg in tibet and optimization of combined fermentation with mixed LAB

WAN Jinmin1，GE Wupeng1，YANG Lina1，WANG Xining2，LIANG Xiuzhen3，WANG Zhi4，QIN Lihu5
(1.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2.Yangling Model District Hospital,Yangling 712100,China;3.Shaanxi Feitian Dairy Co.,Ltd.,Baoji 721100,China;4.Shaanxi BaiYue You Lishi Dairy Co.,Ltd.,Xianyang 712000,China;5.Shaanxi Xi’an Dairy Breeding Center,Xi’an710000,China)

A total of 113 strains of Lactic acid bacteria(LAB)were isolated from yak milk dreg in Tibet.Five LAB strains showing better fermen?tation performance were obtained through preliminary selection by genetic stability,coagulation time,titratable acidity and sensory evalua?tion.There were 4 strains of Lactobacillus(B、C、D、E)and one strain of Staphylococcus(A).They were used in combination to fermented dairy flavor.Optimal fermentation strain combination was obtained throughgrowth and acidic performance,pH,the composite ratio of strains and the content of acetaldehyde and diacetyl.The results showing that:①The curd time and titratable acidity of the 5 strains were 4 to 6 h and 62.57 to 70.40°T;After refrigeration 24 h,titratable acidity were 96.24 to 109.20°T;②The number of live bacteria enrichment perfor?mance and acid production performance index of combinatorial optimization,showed that AB and AC have a good symbiotic relationship. After fermentation of 8 h in skim milk,AB of the highest number of viable cells was 6.46×109mL-1,AC combination of curd acidity was highest.The performance of AC and AB combinations were superior to those of single strains,and the difference was significant(P＜0.05). While there was no significant difference in the fermentation performance between AD and AE(P＞0.05);③The optimal strain combination was AB(1∶1).The number of live bacteria was up to 4.57×109mL-1,curd acidity and after fermentation acidity were 71.54°T,115.30°T.The ac?etaldehyde content of fermented milk products was 36.91 μg/mL and the content of butanedione was 13.82 μg/mL.

yak milk dreg;Lactic acid bacteria;fermented milk yogurt;mixed-culture fermentation

Q93-331

：A

：1001-2230（2017）06-0004-05

2016-11-30

陜西省科技廳戰略性新興產業重大產品（群）項目(2015KTCQ 03-08)及（2016KTCQ03-03）。

萬金敏(1990-)，女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

葛武鵬