SGT基因雜合缺失小鼠血液生理生化指標分析

顧取良，黃 韌，鄶一賀，陳佳園，鄭凌云，王麗京

(1. 廣東藥科大學基礎學院血管生物學研究所，廣州 510006；2.廣東省實驗動物監測所，廣州 510633)

SGT基因雜合缺失小鼠血液生理生化指標分析

顧取良1，黃 韌2，鄶一賀1，陳佳園1，鄭凌云1，王麗京1

(1. 廣東藥科大學基礎學院血管生物學研究所，廣州 510006；2.廣東省實驗動物監測所，廣州 510633)

目的 分析SGT基因雜合缺失對不同年齡小鼠血液指標和代謝的影響。方法 分別采集10周齡、26周齡SGT基因雜合缺失(SGT+/-)小鼠和野生型小鼠眼眶血液，用全自動血細胞分析儀和生化分析儀檢測常用血液生理指標和生化指標，進行不同年齡和基因型間統計比較。結果 與同基因型低齡小鼠對比，高齡小鼠多項血液生理生化指標均發生增齡性改變。與同齡野生型對照相比，10周齡SGT+/-小鼠大血小板比率降低，未結合型膽紅素濃度降低(P<0.05)，其余指標均未見統計學差異；26周齡SGT+/-小鼠血小板計數、血小板比容和中性粒細胞計數降低，堿性磷酸酶、未結合型膽紅素、膽固醇及甘油三酯等指標改變有統計學意義(P<0.05)。結論SGT基因雜合缺失能夠誘發高齡小鼠部分血液、血清生化指標的改變。

SGT；基因缺失；血液學；血液生化

SGT [small glutamine-rich tetratricopeptide repeat (TPR)-containing protein] 蛋白能與HIV-1病毒編碼蛋白U、自主性細小病毒H-1非結構蛋白1及核心蛋白前體GAG(group-specific antigen)等結合，調節病毒顆粒的裝配和釋放，也被稱為病毒蛋白U結合蛋白，其結構特征為分子中間含有三個串聯重復的TPR基序[1]。TPR基序是一個包含34個氨基酸殘基的多肽重復序列，進化過程中高度保守，目前已發現五十多種含TPR基序的蛋白質，含TPR基序的蛋白質廣泛參與各種生物學過程[2]。SGT在多種組織中均有表達，參與多種不同生物學過程，包括細胞周期調控、細胞凋亡、病毒裝配與釋放、激素信號轉導、神經突觸傳導等。SGT可通過與Hsp70及熱休克同源蛋白Hsc70(heat shock cognate protein 70)等相互作用發揮共分子伴侶的功能，參與細胞內蛋白質折疊、轉運及翻譯后修飾等過程，協助介導細胞應激反應[3, 4]。SGT表達改變與前列腺癌、卵巢癌、食管癌、肝癌、朊病毒相關疾病以及淀粉樣阿爾茨海默病等的發生發展相關[5-7]。

目前國內外關于SGT共分子伴侶的功能研究多以體外培養的細胞為主要研究對象，如敲減Hela或NBE細胞中SGT表達，能夠有效抑制細胞有絲分裂并促進細胞凋亡[3]。鑒于SGT組織表達及生物學功能的廣泛性，我們構建了SGT基因缺失雜合子(SGT+/-)小鼠，以便從整體水平研究該基因及其產物在體內的生理功能。本文以SGT基因野生型(SGT+/+)同窩小鼠為對照，對構建的SGT+/-小鼠血液生理生化指標進行檢測分析，為利用該基因工程小鼠研究SGT的生物學功能和在相關疾病的作用及其發生機制提供基礎資料及重要線索。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環境

SGT+/-小鼠由上海生命科學院構建贈送(129；B6背景，與C57BL/6小鼠回交已達8代以上)，同窩野生型(SGT+/+)小鼠作為對照，雌雄不限，實驗動物生產許可證號：【SCXK(蘇)2010-0001】。10周齡及26周齡不同背景各8只，體重16～25 g。按照SPF標準進行飼養，實驗動物使用許可證號：【SYXK(粵)2012-0125】。

1.2 試劑

2× PCR Master Mix購自Thermo Fisher Scientific，DNA Ladder DL2000和組織細胞DNA提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司，PCR引物由上海生工生物公司合成。

1.3 動物實驗

1.3.1 小鼠SGT基因型鑒定：剪取小鼠尾尖約3～5 mm，按說明書提取小鼠基因組DNA作為PCR反應模板。小鼠SGT基因型鑒定所用引物序列為G1：5′-GGGAATAGATGTGCACTAGC-3′，G2：5′-TAGAC ATGCTTGTGTGACCC-3′， G3：5′-TAGGGGAGGAG TAGAAGGTG-3′，引物對G1/G2用于野生型SGT基因擴增，產物大小為508 bp；引物對G1/G3用于SGT缺失的基因型擴增，產物大小為519 bp。美國應用生物系統公司PCR儀常規條件擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統分析。

1.3.2 小鼠血液生理指標測定：禁食12 h后，小鼠眼眶后靜脈叢采血入EDTA-K2抗凝管。采用日本Sysmex XT-2000i型動物全血細胞分析儀檢測白細胞(WBC)計數、紅細胞(RBC)計數、血紅蛋白(HGB) 含量、紅細胞比容(HCT)、紅細胞平均體積(MCV)、紅細胞平均血紅蛋白含量(MCH)、血小板(PLT)計數、平均血小板體積(MPV)、大血小板比率(P-LCR)、血小板比容(PCT)、中性粒細胞(NEUT)、淋巴細胞(LYMPH)、單核細胞(MONO)、嗜酸性粒細胞(EOS)、嗜堿性粒細胞(BASO)分類計數等血液生理指標。

1.3.3 小鼠血液生化指標測定：禁食12 h后，小鼠眼眶后靜脈叢采血入Eppendorff管。采用日立7020型全自動生化分析儀、廣州科方生物技術有限公司試劑盒測定血清常規生化指標：丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、甘油三酯(TG)、膽固醇(CHOL)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、血糖(GLU)、乳酸脫氫酶(LDH)，計算間接膽紅素(IBIL)(IBIL=TBIL-DBIL)。

2 結果

2.1 小鼠SGT基因型鑒定

如圖1所示，以野生型小鼠(SGT+/+)基因組DNA為模板，引物對G1/G2擴增的產物約為500 bp而引物對G1/G3擴增無特異性產物；以雜合缺失型(SGT+/-)小鼠基因組DNA為模板，引物對G1/G2和引物對G1/G3擴增均產生約500 bp的特異性產物。

圖1 小鼠SGT基因型PCR鑒定電泳圖Fig.1 Mouse SGT genotyping by PCR

2.2SGT+/-和SGT+/+小鼠血液生理指標比較

與同基因型低齡小鼠相比，高齡小鼠多項血液生理指標發生明顯改變，但不同年齡兩種基因型小鼠MCV、MCH、MPV指標未改變；此外，野生型小鼠P-LCR以及SGT+/-小鼠RBC、HGB、HCT、PLT、PCT等未見不同年齡間的統計學差異(#NS)。與同齡野生型相比，10周齡SGT+/-小鼠P-LCR降低(*P<0.05)，其余指標均未見統計學差異；26周齡SGT+/-小鼠PLT計數、PCT及NEUT計數明顯降低，差異有統計學意義(*P< 0.05)，而PLT其他參數、紅細胞相關參數、WBC計數及其他分類計數等均無統計學差異，見表1。

2.3SGT+/-和SGT+/+小鼠血清生化指標比較

與同基因型低齡小鼠對比，高齡小鼠多項血液生化指標均發生改變，而不同年齡組間野生型小鼠血清ALP差異未見統計學意義，SGT+/-小鼠DBIL指標差異未見統計學意義(#NS)。與同齡野生型相比，10周齡SGT+/-小鼠血清TBIL、IBIL升高(*P<0.05)，其余指標均未見統計學差異；26周齡SGT+/-小鼠ALP、TBIL、IBIL升高，CHOL和TG降低，差異有統計學意義(*P< 0.05)，見表2。

3 討論

已證實能夠與SGT發生相互作用的蛋白包括Hsp70、Hsc70、J蛋白家族成員CSP(cysteine string protein)、BCL2關聯永生基因6(BAG6)蛋白、泛素樣蛋白Ubl4A、HIV-1編碼的病毒蛋白U、生長激素受體、雄激素受體等，其中多數蛋白與維持體內蛋白質穩定的分子伴侶功能相關[8, 9]。蛋白質折疊、轉運及翻譯后修飾等過程如果發生錯誤，則有可能促進某些腫瘤發生發展[10]。因此不難理解近年來發現SGT表達改變與多種腫瘤細胞增殖或癌癥預后等病理狀態相關，但目前對于SGT在體內正常的生理功能仍知之甚少。

Tab.1 Comparison of blood physiological indexes in the wild type and heterozygousSGT-deficient

檢測項目(Items)10周齡SGT+/+SGT+/-26周齡SGT+/+SGT+/-白細胞WBC(×109/L)6.42±1.037.95±3.303.93±1.472.73±2.23中性粒細胞NEUT(×109/L)0.64±0.110.76±0.201.08±0.450.43±0.29*淋巴細胞LYMPH(×109/L)4.34±0.844.54±2.522.15±0.621.74±1.63單核細胞MONO(×109/L)1.22±0.161.65±0.760.62±0.300.48±0.40嗜酸性粒細胞EOS(×109/L)0.17±0.060.19±0.030.08±0.100.07±0.08嗜堿性粒細胞BASO(×109/L)0.00±0.000.00±0.000.00±0.00#NS0.00±0.00#NS紅細胞RBC(×1012/L)10.51±1.7311.10±1.1312.43±1.7911.74±1.07#NS血紅蛋白HGB(g/L)155.43±24.27163.88±14.39178.50±22.72170.4±16.38#NS紅細胞比容HCT(%)51.24±8.0454.00±3.9659.3±6.5756.23±4.71#NS紅細胞平均體積MCV(fL)48.87±1.6748.71±1.6847.96±2.71#NS48.36±0.92#NS紅細胞平均血紅蛋白含量MCH(pg)14.81±0.6514.78±0.3214.44±0.67#NS14.53±0.24#NS血小板PLT(×109/L)741.86±311.81746.12±228.071204.50±158.46814.67±304.28*#NS平均血小板體積MPV(fL)6.26±0.206.09±0.136.14±0.14#NS6.20±0.16#NS血小板分布寬度PDW(fL)5.53±0.415.42±0.225.38±0.16#NS5.32±0.23#NS大血小板比率P-LCR(%)3.26±1.401.98±0.57*2.95±0.82#NS3.38±0.80血小板比容PCT(%)0.46±0.180.46±0.140.70±0.160.50±0.18*#NS

注：*：同齡SGT+/-小鼠與SGT+/+小鼠間比較P<0.05；#NS：同基因型小鼠26周齡與10周齡間比較無統計學差異

Note.*: Comparison between groups at the same age,P<0.05.#NS: No statistically significant difference between groups with the same genotype.

Tab.2 Comparison of blood biochemical indexes in the wild type and heterozygousSGT-deficient

檢測項目(Items)10周齡10-week-oldmiceSGT+/+SGT+/-26周齡26-week-oldmiceSGT+/+SGT+/-丙氨酸氨基轉移酶ALT(U/L)22.12±5.4621.67±4.9261.33±16.0659.20±14.80天冬氨酸轉氨酶AST(U/L)54.00±18.6351.33±20.17128.33±36.90129.60±42.51AST/ALT2.46±0.802.30±0.372.17±0.46#NS2.30±0.87#NS總蛋白TP(g/L)29.72±1.3529.70±2.6251.72±2.0150.58±2.02白蛋白ALB(g/L)18.31±0.9618.23±3.0229.82±0.9829.90±1.98球蛋白GLB(g/L)11.41±0.5111.47±0.4421.90±1.6420.68±1.67總膽紅素TBIL(μmol/L)0.30±0.180.77±0.44*1.45±0.412.06±0.58*直接膽紅素DBIL(μmol/L)0.10±0.010.27±0.290.47±0.230.48±0.27#NS間接膽紅素IBIL(μmol/L)0.20±0.180.50±0.24*0.98±0.271.58±0.40*堿性磷酸酶ALP(U/L)95.75±31.3992.33±11.8293.33±29.17#NS141.80±25.03*血糖GLU(mmol/L)7.22±0.337.53±0.8412.00±2.1511.06±2.31尿素氮BUN(g/L)7.31±1.837.29±0.7413.00±3.7611.59±2.16肌酐CREA(μmol/L)6.88±3.044.33±3.2815.00±3.2916.60±1.52膽固醇CHOL(mmol/L)1.08±0.061.10±0.132.47±0.201.85±0.10*甘油三酯TG(mmol/L)0.46±0.120.39±0.030.94±0.270.67±0.22*乳酸脫氫酶LDH(U/L)220.62±38.52255.00±88.13621.33±220.02524.40±131.25

注：*：同齡SGT+/-小鼠與SGT+/+小鼠間比較P<0.05；#NS：同基因型小鼠10周齡與26周齡間差異比較無統計學意義

Note.*: Comparison between groups at the same age,P<0.05.#NS: No statistically significant difference between groups with the same genotype.

Winnefeld等[11]報道，利用siRNA下調細胞內源性SGT表達能夠導致胞質分裂缺陷、染色體排列不能完成而使有絲分裂受阻，從而降低細胞增殖和細胞存活率。鑒于SGT表達和參與生物學過程的廣泛性及其對生命活動的重要性[12]，推測動物體內降低SGT表達水平可能造成致死性，因此我們部分敲減了小鼠體內SGT表達。結果獲得了存活的SGT基因雜合缺陷(SGT+/-)小鼠，這可能是由于在不同類型的細胞中SGT發揮不同的作用，如Wang等[13]報道過表達SGT使人肝癌7721細胞對凋亡事件敏感性增加，還可能與體內共分子伴侶系統的冗余性有關，可能有其他含TPR基序的共分子伴侶表達上調、實現了部分功能代償，具體機制有待進一步檢測各組織SGT同源異構體蛋白、TRP2、CHIP(carboxy-terminus of Hsp70 interacting protein)等其他共分子伴侶的表達情況后分析探討[14]。

與野生型同窩對照相比，構建的SGT+/-小鼠大體觀察未顯示繁育率、生存率差異或行為學異常等癥狀。實驗動物的血液生理生化指標在一定程度上能反映動物的新陳代謝、生理機能和健康狀況，對病理學等相關實驗的研究具有重要的參考價值[15]。本實驗分別選擇10周、26周SGT基因野生型(SGT+/+)和雜合型(SGT+/-)的小鼠，檢測比較不同年齡階段SGT基因缺失對血液生理生化指標的影響。兩組10周齡小鼠的血液生理指標比較結果顯示，SGT基因雜合缺失對低齡小鼠血液生理指標幾乎沒有影響，除了P-LCR即大血小板比率有一定程度的下降。血小板參數PLT、MPV、PDW、P-LCR、PCT通常需要綜合考慮，單純P-LCR下降僅提示血小板成熟度較高或者血小板生成不活躍，可能會造成機體凝血時間有所延長，但對這種改變出現的原因有待進一步考證。兩組26周齡小鼠的血液生理指標比較顯示，SGT+/-小鼠血液血小板數量下降約30%、血小板比容(PCT)相應降低，MPV、PDW、P-LCR等均沒有明顯變化，即血小板活化狀態沒有明顯變化，而同時，紅細胞參數和功能亦沒有受到影響。體內血小板生成是一個復雜的過程，血小板數量減少的原因一般是血小板生成障礙或血小板破壞增加。若因血小板破壞增加所致，則將在骨髓功能正常時反饋激活巨核細胞，產生體積更大的血小板，使MPV增大，并由于新生PLT大小不一使PDW也增大。而若是骨髓增生低下所致，則其MPV、PDW 也將減小。綜合上述結果分析，高齡SGT+/-小鼠血液中血小板減少的原因可能是巨核細胞成熟不良導致釋放血小板異常所致，需要進行骨髓細胞成分檢測以證實，同時提示，26周齡SGT+/-小鼠凝血功能受到影響，機體凝血時間和出血時間將會延長，后續研究將對血小板功能進行檢測。血象檢查還觀察到SGT+/-小鼠血液中性粒細胞計數低于對照組，總白細胞計數有下降趨勢，而其他白細胞分類計數無明顯差異，但原因不明。這也進一步佐證了SGT在不同的特定細胞環境中發揮不同的生物學效應。

小鼠血液生化指標比較結果顯示，SGT基因雜合缺失對低齡小鼠血液生化指標的影響僅表現為總膽紅素(TBIL)和IBIL即未結合膽紅素有所升高，對高齡小鼠血液生化的影響則還包括血清ALP升高以及TG和CHOL水平下降。膽紅素的主要來源是紅細胞的血紅蛋白，而SGT+/-小鼠血液紅細胞參數基本沒有改變，因而無法確定血清ALP、TBIL和IBIL三者升高的共同原因，僅推測可能與催化II相反應的轉移酶不足及輕微膽道阻塞有關。此外，近年研究認為適當較高濃度的BIL能夠清除氧自由基、減少氧化型低密度脂蛋白的生成，總膽紅素和間接膽紅素含量降低與急性腦梗死有密切關聯，頸動脈斑塊患者血清間接膽紅素較低[16]，因而SGT+/-小鼠較高的TBIL血清水平還可能與血管內皮細胞保護作用增強有關，預示其心腦血管疾病易患風險較低，這也與26周齡SGT+/-小鼠血清TG和CHOL水平較低基本相符。

總之，相對于低齡小鼠而言，SGT基因雜合缺失對高齡小鼠誘發的部分血液生理生化指標變化更明顯。其中，血清血紅素的變化在低齡和高齡組均具有統計學意義但高齡組差異更顯著，而其他指標在不同年齡組呈現不同的變化，提示年齡與SGT基因雜合缺失共同影響小鼠生理生化指標，即這些指標的變化是其功能減弱后的間接反應。由于共分子伴侶在機體應激時發生的蛋白質去折疊或正確折疊及蛋白質運輸中發揮必不可少的功能，可以預測，在應激狀態下SGT+/-小鼠或SGT基因敲除(SGT-/-)小鼠將表現出更明顯的表型差異。另外，考慮到血小板和中性粒細胞均在介導炎癥反應中起著重要作用[17]，后續研究可在炎癥相關疾病如深靜脈血栓、動脈粥樣硬化、老年性癡呆、炎癥相關性結腸癌等模型上進行。

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Analysis of hematological and biochemical parameters of heterozygousSGT-deficient mice in young and elderly ages

GU Qu-liang1, HUANG Ren2, KUAI Yi-he1, CHEN Jia-yuan1, ZHENG Ling-yun1, WANG Li-jing1

(1. Vascular Biology Research Institute, School of Basic Sciences, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China; 2. Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangzhou 510633)

Objective To study the effect of heterozygous deficiency ofSGTgene on the hematological and biochemical parameters of mice in young and elderly ages．Methods Blood samples were analyzed for complete hematological and biochemical parameters from heterozygousSGT-deficient and wild-type mice of 10-weeks and 6-months old mice, respectively. Results Age-related changes in most indexes were found statistically significantly different between young and elderly mice with the same genotype. Compared with the wild type at the same age, the platelet large cell ratio (P-LCR) was lower in young heterozygousSGT-deficient mice. However, platelet count, plateletcrit (PCT) and neutrophil count were more significantly lower in elderly heterozygousSGT-deficient mice (P<0.05). There was no significant difference for biochemical parameters ALT, AST, LDH, urea nitrogen, creatinine and blood glucose. Total and unconjugated bilirubin as well as ALP were significantly higher in elderly heterozygousSGT-deficient mice but not for conjugated bilirubin (P<0.05). In addition, significant differences existed for the lipids between two elderly groups (P<0.05). Conclusions Heterozygous deficiency ofSGTgene induced changes of some hematological and biochemical parameters in elderly mice. It provides helpful information for further investigation onSGTinvolvement in some biological and pathological processes.

SGT; Heterozygous deficiency; Hematology; Blood biochemistry; Platelets; Mice; Aging

國家自然科學基金項目(編號：44164006，31200861，31100852)。

顧取良(1979-)，女，研究方向：腫瘤分子生物學。E-mail： qlgu@gdpu.edu.cn。

王麗京(1962-)，女，研究方向：分子病理學。E-mail： wanglijing@gdpu.edu.cn。

研究報告

R-33

A

1671-7856(2017) 06-0022-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.005

2017-01-24