骨質疏松大鼠骨髓基質細胞膜片的體外構建研究

何夢嬌 江俊 鄭寶玉 許雄程 吳玉銘 林敏魁 陳玉玲 駱凱*

1.福建醫科大學附屬口腔醫院，福建 福州 350002 2.溫州醫科大學附屬口腔醫院，浙江 溫州 325027 3.福建省高?？谇会t學重點實驗室，福建 福州 350002

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量及骨密度減少、骨微結構破壞為特征的骨代謝疾病，可導致骨脆性增加，易發生骨折，嚴重危害廣大中老年人的健康和生活質量[1]。如何實現OP患者骨組織的再生是學者們研究的重點。組織工程技術利用種子細胞、支架材料和細胞、生長因子的共同協同作用以實現功能性組織再生。但由于支架材料存在潛在的免疫源性、較低的生物活性、不匹配的降解速率以及難以控制的細胞與材料間的交互作用等缺點使其在臨床上的應用受到限制[2]。為此，學者們提出了細胞膜片技術(cell sheet technology，CST)。采用CST無需使用支架材料，可無創性地獲取細胞，避免了酶消化對細胞生物學功能的損傷，不僅保留了完整的細胞外基質，同時還保留了重要離子通道和生長因子受體等，可以促進細胞間及細胞與胞外基質間的相互作用[3]。近年來，CST已廣泛應用于組織與器官重建，包括腎[4]、心肌組織[5]、角膜[6]、牙髓-牙本質復合體[7]、皮膚[8]等。

本研究利用絕經后骨質疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)大鼠模型的骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)為種子細胞構建細胞膜片并研究其生物學特性，為探討OP狀態下BMSCs膜片應用于組織再生的相關研究提供基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

同批次3月齡雌性未孕Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重250～290 g，SPF級，購自福建醫科大學，動物許可證號：SYXK(閩)2012-0001。

1.2 主要試劑與儀器

低糖DMEM培養基、胎牛血清(Hyclone，美國)；0.25%胰蛋白酶、谷氨酰胺(Gibico BRL，美國)；DMSO、地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉(Sigma，美國)；成脂誘導分化完全培養基(賽業，廣州)；兔抗大鼠Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ, COL-Ⅰ)、兔抗大鼠纖維連接蛋白(fibronectin, FN)(Abcam，美國)；即用型非生物素免疫組化EliVisionTMplus檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(邁新，福州)；HEAL FORCE 超凈工作臺(力申科學儀器有限公司，上海)；離心機(Eppendorf，德國)；CO2細胞培養箱(Heraeus，德國)；熒光倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)。

1.3 SD大鼠PMOP模型的建立及鑒定

參照課題組方法[9]隨機將SD大鼠分為卵巢切除術組(ovariectomy，OVX)和假手術組(sham-operated，Sham)，每組各10只。OVX組大鼠進行雙側卵巢摘除術，Sham組僅切取卵巢附近與卵巢大小相近的脂肪組織。術后根據組別分籠常規喂養。術后6周、術后12周比較兩組大鼠體型及體重，并取單側股骨作病理切片比較分析，以確認建立SD大鼠骨質疏松癥模型。

1.4 O-rBMSCs體外分離培養

采用全骨髓貼壁分離法[10]分離培養O-rBMSCs。全麻下消毒、鋪巾，迅速取出完整股骨及脛骨，無菌條件下以10mLDMEM低糖培養液從兩端交替沖洗骨髓腔收集骨髓沖洗液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，DMEM低糖培養液(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L，10%FBS)重懸，置于37 ℃、5 %CO2、飽和濕度的CO2細胞培養箱中培養。第3 d首次半量換液，之后每隔3 d換液 1 次。待細胞密度至80% ～ 90%融合時以0.25%胰蛋白酶+0.1 % EDTA消化傳代，實驗選擇3代以內的細胞進行。

1.5 O-rBMSCs成骨及成脂誘導分化

O-rBMSCs按每孔1×105個接種于6孔板，待細胞生長至60%～70%融合時，成骨誘導組更換為成骨誘導液(基礎培養液中加入50 μg/mL 維生素C，10 mmol/L β-磷酸甘油，10 nmol/L地塞米松)，成脂誘導組更換為成脂誘導液，每3 d換液，于誘導21 d后棄原培養液，固定，成骨誘導組行茜素紅染色觀察礦化結節，成脂誘導組行油紅O染色觀察脂滴。

1.6 O-rBMSCs膜片的構建

選取生長狀態良好的第2代或第3代O-rBMSCs，按2×105/孔密度接種于六孔板，加入膜片誘導培養液(基礎培養液中加入50 μg/mL 維生素C)，2～3 d更換培養液，連續培養10 d左右用細胞刮刀沿培養皿邊緣小心分離獲得細胞膜片。

1.7 O-rBMSCs膜片形態學觀察

選取完整的O-rBMSCs膜片，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，浸蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色觀察膜片結構。部分膜片經2.5% 戊二醛固定，梯度酒精脫水，干燥，噴金，掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)觀察標本表面形貌及層面結構。部分膜片經2.5% 戊二醛固定，1%鋨酸固定，梯度酒精脫水后環氧樹脂包埋，超薄切片，透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察細胞膜片超微結構。

1.8 O-rBMSCs膜片免疫組織化學染色

石蠟切片常規脫蠟，過氧化氫溶液室溫孵育消除內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉，4 ℃下孵育一抗COL-Ⅰ(抗體稀釋度1∶500)、FN(抗體稀釋度1∶800)，室溫下孵育生物素標記二抗，滴加辣根酶標記鏈霉素抗生物素蛋白—過氧化酶DAB顯色，蘇木精復染，梯度酒精逐級脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 SD大鼠PMOP模型建立

術后6周、術后12周，OVX大鼠體重明顯大于Sham組大鼠，差異有統計學意義(P<0.05)(圖1)。術后12周，OVX組大鼠的體型明顯大于Sham組大鼠，行動較遲緩，毛色較暗沉。股骨遠端骨組織HE染色顯示，與Sham組相比，OVX組大鼠的股骨遠端松質骨吸收明顯，骨小梁斷裂且數目明顯減少，骨小梁變細從而使得骨髓腔面積變大(圖2)，提示骨質疏松造模成功。

圖1 兩組大鼠手術前后體重比較(** P <0.01)Fig.1 Comparison of body weight before and after ovariectomy in the two groups of rats(**P<0.01)

圖2 卵巢切除術后12w兩組大鼠股骨組織學形態比較(標尺 200 μm)A: Sham組B: OVX組Fig.2 Comparison of femur histological morphology after ovariectomy between the two groups of rats (Bars 200 μm)A: Sham group；B: OVX group

2.2 O-rBMSCs體外培養的形態學觀察

PMOP大鼠骨髓沖洗液可見大量的油脂浮于表面，經離心后可基本棄去。3 d半量換液后，倒置顯微鏡下仍可見較多的紅細胞和光亮的圓形細胞，隱約可見少量貼壁細胞，呈短梭形或紡錘形，脂滴較多(圖3A)。培養7 d左右，細胞呈纖維集落樣生長，形態多為多角形，邊緣粗糙(圖3B)。培養14 d左右即可達到80%融合并可傳代。

2.3 O-rBMSCs誘導分化實驗

O-rBMSCs經成骨誘導21 d后，細胞形態由梭形變為圓形、立方形，細胞復層生長明顯，局部可見高亮的礦化結節點，經茜素紅染色后可見紅色結節形成(圖3C)。O-rBMSCs 經成脂誘導21 d后，細胞形態由梭形變為類圓形，類圓形細胞胞漿內有大量脂滴形成，經油紅O染色后，可見紅色脂滴(圖3D)。

圖3 O-rBMSCs體外培養及誘導分化(標尺 100 μm)A：O-rBMSCs原代培養3 d；B：O-rBMSCs原代培養7 d；C：O-rBMSCs茜素紅染色；D：O-rBMSCs油紅O染色Fig.3 The culture and induction of O-rBMSCs in vitro (Bars 100 μm)A: O-rBMSCs primary culture 3 d.B: O-rBMSCs primary culture 7 d.C:O-rBMSCs Alizarin red staining.D: O-rBMSCs Oil red O staining

2.4 O-rBMSCs膜片的形態學觀察及免疫組化染色結果

連續培養10 d左右，細胞膜片即可形成，6孔板底部可見白色膜樣結構，邊緣卷曲(圖4B)。顯微鏡下見細胞呈復層生長，于邊緣逐漸向中心收縮。用細胞刮刀由邊緣向中心刮取即可獲取完整細胞膜片(圖4A)，刮取后膜片自行收縮，置于PBS中可伸展開，具有較好的彈性及機械性能。HE染色顯示O-rBMSCs膜片由2～3層細胞及豐富的細胞外基質組成(圖4C)。掃描電鏡觀察可見膜片中細胞復層生長，可見大量的細胞外基質存在于細胞間(圖4D)。透射電鏡觀察可見細胞、細胞外基質(圖4E箭頭所示)以及細胞間連接(圖4F箭頭所示)。免疫組化染色結果顯示，O-rBMSCs膜片高表達COL-Ⅰ及FN(圖5)。

圖5 O-rBMSCs膜片免疫組織化學染色(標尺50 μm)A：陰性對照組；B：COL-Ⅰ蛋白表達情況；C：FN蛋白表達情況Fig.5 Immunohistochemical staining of O-rBMSC sheet (Bars 50 μm).A: Negative control group.B: The expression of COL-Ⅰ.C: The expression of FN

圖4 O-rBMSCs膜片形態學觀察A：O-rBMSCs膜片外觀觀察；B：O-rBMSCs膜片顯微鏡觀察(標尺500 μm) ；C：O-rBMSCs膜片HE染色觀察(標尺50 μm) ；D：O-rBMSCs膜片掃描電鏡觀察(箭頭所指為細胞外基質) ；E：O-rBMSCs膜片透射電鏡觀察(箭頭所指為細胞外基質)；F：O-rBMSCs膜片透射電鏡觀察(箭頭所指為細胞間連接)Fig.4 Morphological observation of O-rBMSC sheet.A: Appearance image of O-rBMSC sheet.B: Microscope image ofO-rBMSC sheet (Bars 500 μm).C: HE staining image ofO-rBMSC sheet (Bars 50 μm).D: SEM image ofO-rBMSC sheet (Arrows indicate the ECM).E: TEM image ofO-rBMSC sheet (Arrows indicate the ECM).F: TEM image ofO-rBMSC sheet (Arrows indicate the intercellular junction)

3 討論

隨著社會人口的老齡化，OP發病率和患病率顯著升高，不僅影響中老年人的生活質量，也給社會和家庭帶來沉重的負擔，是影響中老年人健康的重大公共衛生問題之一。原發性骨質疏松癥分為絕經后骨質疏松癥(Ⅰ型)、老年性骨質疏松癥(Ⅱ型)和特發性骨質疏松(包括青少年型)三種。目前，卵巢切除法構建的動物模型是OP防治研究的一種重要方法，去卵巢的雌性大鼠模型已成為研究PMOP的經典模型之一[11]。本研究采用去勢法構建大鼠PMOP模型，術后12周，OVX組大鼠體型及體重明顯大于Sham組，股骨遠端骨組織染色可見骨小梁數目明顯減少，骨小梁變薄，該結果提示PMOP模型構建成功。

目前，OP治療多采用抗骨吸收藥物(如雙膦酸鹽)和促骨形成藥物(如甲狀旁腺素)以抑制破骨細胞吸收和促進骨形成[12]。然而，已有研究報道OP患者應用此類藥物后由于骨重建功能障礙而引起藥物相關性頜骨壞死等不良反應[13, 14]。一些臨床前研究表明干細胞療法對OP有積極的治療意義，BMSCs移植被認為是很有潛力的治療方法[15, 16]。BMSCs具有自我更新及多向分化潛能，在維持骨量、骨強度及骨結構的完整性方面發揮重要作用。BMSCs來源豐富，采集方便，易于體外分離培養、誘導及擴增。作為同源細胞治療，無免疫原性，便于自體回植，可實現骨組織的再生，是組織工程研究理想的種子細胞。課題組前期的研究發現PMOP大鼠BMSCs經瘦素基因修飾后可顯著提高細胞的體內外成骨能力，該結果為OP狀態下BMSCs的臨床應用提供了實驗依據[10]。

CST是通過體外連續培養細胞使其復層生長，形成由細胞和細胞外基質構成的膜片。構建細胞膜片的方法多種多樣，目前較為常用的有溫度敏感性培養皿法[17]和維生素C連續誘導培養法[18]。維生素C是人體健康的必需營養素，在膠原和其他胞外基質合成中發揮重要作用。維生素C連續誘導培養法簡單易行，無需特殊材料或方法，獲得的細胞膜片由多層細胞及細胞外基質構成，一定的厚度賦予膜片相應的彈性和較穩定的機械性能。Wei等[18]研究表明維生素C可誘導牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)端粒酶活性，上調胞外基質、促進干細胞表面標志物和成骨分化標志物的表達，提高PDLSCs增殖和成骨分化能力。在小型豬牙周缺損模型上采用維生素C誘導的PDLSCs膜片可促進牙周組織再生。Zhang等[19]以50 μg/mL的維生素C構建PDLDCs膜片、下頜骨骨髓間充質干細胞(jaw bone marrow-derived mesenchemal stem cells, JBMMSCs)膜片及PDLSCs-JBMMScs復合細胞膜片，探討兩種不同來源細胞膜片的相互作用，研究證明復合細胞膜片高表達成骨及胞外基質相關基因及蛋白，體內形成的復合物結構與天然牙周組織更為相似。上述結果提示維生素C誘導CST將為組織再生工程提供一個簡單可行的方法。

在BMSCs膜片構建方面，See等[20]通過連續誘導培養成功制備BMSCs膜片，膜片內的BMSCs有較好活力且分泌大量胞外基質，膜片經誘導分化后可向成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞分化，提示BMSCs膜片有望用于組織再生治療。Nakamura等[21]以地塞米松和維生素C誘導BMSCs膜片形成，植入大鼠股骨骨折缺損模型，結果顯示該膜片可促進骨折的愈合。其他學者[22]研究還發現BMSCs膜片與煅燒牛骨復合構建3D支架結構，移植到骨質疏松大鼠顱骨臨界骨缺損(直徑8 mm)后，3D結構中的BMSCs膜片仍具有活力且參與新骨的形成。Wang等[23]將負載microRNA-21的殼聚糖/透明質酸納米顆粒包裹在培養皿上后，以維生素C誘導的方法在此培養皿上可構建出BMSCs膜片，一系列檢測表明miRNA-21可顯著促進BMSCs膜片的體外成骨分化能力。但上述研究中所采用的種子細胞均為健康狀態，以OP態下BMSCs作為種子細胞構建細胞膜片的相關研究目前還鮮見報道。

本實驗采用50 μg/mL的維生素C體外連續培養PMOP大鼠BMSCs 10 d左右，構建出完整的O-rBMSCs膜片。該膜片刮取后可自行收縮，置于PBS中可伸展開，具有較好的彈性及機械性能。HE染色顯示O-rBMSCs膜片由2～3層細胞及豐富的細胞外基質組成。掃描電鏡觀察可見膜片中細胞由細胞外基質包埋。透射電鏡觀察可見細胞、細胞外基質以及細胞間連接。

細胞外基質是由多種蛋白和多聚糖構成的精細復雜的網絡結構，其基本成分包括COL-Ⅰ、FN及層黏連蛋白(laminin, LN)等。COL-Ⅰ是細胞黏附的主要支架，也是新形成組織的主要成分[24]。在膜片中還作為細胞間相互連接的載體。FN是多種細胞外基質蛋白質整合的關鍵因子，連接細胞表面受體(如整合素)和多種化合物(如膠原、蛋白多糖及其他粘附分子)。同時FN在原纖蛋白-1的整合中發揮重要作用[25]。本研究免疫組織化學染色顯示，O-rBMSCs膜片高表達COL-Ⅰ、FN等細胞外基質相關蛋白，提示O-rBMSCs膜片具有生物學功能。

綜上所述，本實驗在成功構建大鼠PMOP模型、分離培養O-rBMSCs的基礎上，利用維生素C連續誘導培養10 d左右成功構建了O-rBMSCs膜片，該膜片由多層細胞和豐富的細胞外基質組成，具有較好的彈性及機械性能，說明這是一套較為穩定的在體外構建O-rBMSCs膜片的方法。同時，該膜片高表達COL-Ⅰ、FN等細胞外基質相關蛋白。但是，確定O-rBMSCs膜片形成的最適維生素C濃度以及O-rBMSCs膜片的體內成骨能力需要進一步實驗加以探討。