基于JNK信號通路探討豨薟草對痛風性關節炎影響

徐軼爾 于雪峰 陳水林 韓忠麗 孫貴才*

1.哈藥集團藥物研究院，黑龍江 哈爾濱 150025 2.南昌大學第四附屬醫院，江西 南昌 330003 3.哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150086

痛風性關節炎(gouty arthritis，GA)是由于血液中尿酸增高，尿酸鹽結晶析出，沉積在滑膜、軟骨、關節囊和骨質等關節組織，引起關節滑膜及周圍組織病理性損傷和炎癥反應[1]。隨著人們飲食結構和生活方式的變化，痛風患者的比例逐年上升，致殘率和致畸率較高，給人們的生活和健康帶來不便。目前尚無確切的治療方法根治GA，現在主要的治療目的就是及時控制急性發作，并減低血液中尿酸，減少尿酸鹽沉積，降低關節損傷等，臨床上痛風性關節炎急性發作常用秋水仙堿治療，然而秋水仙堿可導致嚴重的肝臟、腎臟和骨髓的損傷[2,3]。因此，尋找一種低毒、高效的治療藥物，仍是GA治療應該急需解決的關鍵問題。

豨薟草味辛、苦、寒，具有祛風濕、利關節和解毒之功效，主要用于治療風濕痹癥，關節疼痛，筋骨無力，腰膝酸軟等[4]。我們前期研究發現以豨薟草為主藥的復方豨薟草膠囊能夠明顯降低痛風性關節炎模型大鼠血清中IL-1β和IL-6水平、明顯降低炎性因子的釋放，降低NF-κB的轉錄，明顯改善痛風性關節癥狀[5,6]。以往的研究發現尿酸鈉結晶沉積在關節后，能夠激活多種信號通路參與GA炎癥的發生發展，絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)細胞信號通路激活白細胞，誘導前炎性細胞因子、生長因子和趨化因子等炎性因子的合成和釋放[7]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)作為MAPK家族主要成員之一，參與多種生物學反應及疾病的發生發展，因此，本實驗以JNK信號通路為基礎，探討痛風性關節炎的發生發展與JNK信號通路之間的關系及中藥豨薟草干預機制影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與動物

豨薟草購于哈爾濱市同仁堂大藥房；SP600125(JNK抑制劑)和尿酸鈉(Uric acid sodium salt，U2875-5G) 購自美國Sigma 公司；大鼠白細胞介素IL-1、白細胞介素IL-8和腫瘤壞死因子TNF-α酶聯免疫試劑盒購于美國R&D 公司；JNK和p-JNK購于英國abcam公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；實驗動物由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.2 豨薟草提取物制備

將豨薟草藥材40 ℃烘干，粉碎成干粉，然后加入10倍水于80 ℃提取兩次，每次提取30 min。過濾，棄去濾渣，合并濾液，過濾，將溶液濃縮至100 mL，離心2 000 r/min，10 min，取上清液，備用。

1.3 痛風性關節炎模型建立[8,9]及分組

將雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、SP600125組(JNK抑制劑)和豨薟草高(4 g/kg)、中(2 g/kg)、低(1 g/kg)組，各組分別給予生理鹽水或藥物5天，末次給藥1 h后，大鼠膝關節腔注射尿酸鈉0.2ml(20 mg/ mL)，對照組膝關節腔注射生理鹽水0.2 mL,各組大鼠造模后再繼續灌胃給藥2天[10]。

1.4 滑膜組織形態學檢測

取各組大鼠滑膜組織，4 % 多聚甲醛固定, 梯度乙醇脫水, 二甲苯透明, 浸蠟, 石蠟包埋切片, 二甲苯進行脫蠟，梯度濃度的乙醇進行水化，Harris蘇木精染色3～5 min，蒸餾水沖洗1 min，75%鹽酸乙醇分化數秒鐘，蒸餾水沖洗10 min至細胞核呈藍色，0.5%伊紅水溶液1 min，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 痛風性關節炎大鼠血清中TNF-α，IL-1和IL-8含量測定

采集各組大鼠腹主動脈血液，3 500 r/min，離心15 min，收集血清，按照ELISA試劑盒說明書要求測定TNF-α，IL-1和IL-8含量。

1.6 實時定量PCR檢測滑膜組織中c-Jun、AP-1和NF-κB mRNA表達

c-Jun、AP-1和NF-κB mRNA引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：c-Jun上游5′-TAC GCTGCCCAGTGTCACCT-3′，下游5′-CGT CTGCGGCTCTTCCTTCA-3′，AP-1上游5′-TGGGCACATCACCACTACA C-3′，下游5′-TCTGGCTATGCAGTTCAGCC-3′, NF-κB上游5′-GCTATGTGTGT GAAGGCCCA-3′，下游5′-TGCAAATTTTGACCTGTGGGT-3′。取各組滑膜組織100 mg，按TRIZOL法提取總RNA，并按照逆轉錄試劑盒說明將提取的總mRNA逆轉錄成cDNA，并應用cDNA用于實時定量PCR檢測。

1.7 滑膜組織中JNK和p-JNK蛋白表達

取各組滑膜組織100 mg，加入組織裂解液提取滑膜組織總蛋白，經SDS-PAGE電泳分離，轉移至PVDF膜上， 5%脫脂奶粉室溫孵育2 h后，加入一抗工作液，4 ℃過夜， TBS-T緩沖液洗膜5次，10 min/次，加入二抗工作液，室溫孵育1 h，TBS-T洗膜5次，10 min/次，采用ECL法顯色。凝膠成像系統拍照并分析。

1.8 統計分析

2 結果

2.1 病理形態學觀察

如圖1所示，在顯微鏡下觀察，對照組滑膜細胞間彼此排列疏松，滑膜細胞之間為膠原性間質，無炎性細胞浸潤；模型組炎癥明顯，炎性細胞浸潤，滑膜細胞增生，成纖維細胞及小血管增生, 纖維炎性蛋白滲出物；SP600125組和豨薟草高、中、低組炎性細胞浸潤明顯減少，滑膜細胞增生和成纖維細胞增生明顯減輕，且豨薟草對滑膜組織的炎癥影響呈劑量依賴性。

圖1 痛風性關節炎大鼠滑膜組織病理變化(HE染色，原始圖片放大100倍)Fig.1 Pathological changes of rat synovial tissue with gouty arthritis (stained with hematoxylin and eosin, original magnification×100)

2.2 大鼠血清中TNF-α，IL-1和IL-8含量測定

如表1所示，與對照組比較，模型組痛風性關節炎大鼠血清中炎性因子TNF-α，IL-1和IL-8含量明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，SP600125組和豨薟草高、中、低組痛風性關節炎大鼠血清中炎性因子TNF-α，IL-1和IL-8含量明顯降低(P<0.05)，且隨著豨薟草的劑量增加抑制炎性因子的釋放明顯。

組別IL-1(pg/mL)IL-8(pg/mL)TNF-α(pg/mL)對照組145.85±9.42394.22±15.4428.64±0.05模型組1563.62±36.84?589.82±21.37?85.87±0.16?SP600125組1249.11±25.31#458.72±19.64#54.41±0.13#4 g/kgHSG406.81±26.16#429.59±18.55#32.87±0.14#2 g/kgHSG982.43±18.45#467.82±23.49#41.93±0.09#1 g/kgHSG1364.65±27.11#504.88±20.44#59.41±0.12#

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05
Compared with the control group,*P<0.05；compared with the model group,#P<0.05

2.3 滑膜組織中c-Jun、AP-1和 NF-κB mRNA表達

如表2所示，與對照組比較，模型組滑膜組織中c-Jun、AP-1和 NF-κB mRNA表達明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，SP600125組和豨薟草高、中、低組滑膜組織中c-Jun、AP-1和 NF-κB mRNA表達降低(P<0.05)，在一定劑量范圍內豨薟草對滑膜組織中c-Jun、AP-1和 NF-κB mRNA表達呈正相關。

組別c-jun/GAPDHAP-1/GAPDHNF-ΚB/GAPDH對照組1±0.091±0.081±0.12模型組8.89±0.57?9.65±0.86?10.62±0.97?SP600125組4.38±0.29#4.62±0.53#4.97±0.33#4 g/kgHSG2.57±0.19#3.61±0.25#3.98±0.31#2 g/kgHSG5.68±0.43#6.05±0.56#6.14±0.49#1 g/kgHSG7.08±0.85#7.26±0.43#7.66±0.52#

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。
Compared with the control group,*P<0.05; compared with the model group,#P<0.05.

2.4 滑膜組織中JNK和p-JNK蛋白表達

如圖2所示，與對照組比較，模型組滑膜組織中JNK和p-JNK蛋白的明顯增加(P<0.05)；SP600125組處理后痛風性關節炎大鼠滑膜組織中JNK和p-JNK蛋白顯著降低(P<0.05)；給予豨薟草高、中、低劑量后痛風性關節炎大鼠滑膜組織中JNK和p-JNK蛋白明顯降低(P<0.05)，隨著劑量的增加對JNK和p-JNK的影響逐漸增大。

圖2 不同濃度豨薟草對滑膜組織中JNK和p-JNK蛋白表達影響Fig.2 Effect of different concentrations of Herba Siegesbeckiae on JNK and p-JNK protein expression in synovial tissue

3 討論

c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase, JNK)是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族主要成員之一。JNK信號通路參與細胞增殖、分化、凋亡和惡變以及維持細胞形態和細胞骨架構建等多種生物學反應[11]。JNK信號通路可以被熱休克、氧化損傷、細胞因子、表皮生長因子等多種因素激活，JNK信號通路功能異常可造成缺血再灌注損傷、慢性炎癥和神經退行性病變等多種疾病。研究早期發現JNK被認為是一種特異性激活核內轉錄因子c-jun的活性，提高活化蛋白1(AP-1)的轉錄[12]；最近研究發現核內轉錄因子ELK-1、P53和c-Myc及Bcl2家族(Bcl2、BAD)也是JNK的底物，表明JNK可以直接快速的發揮生物學效應[13-16]。因此，JNK有望成為臨床上的一個潛在的治療靶點，調節相關疾病的發生發展。

痛風性關節炎的發病機制復雜，研究證實痛風性關節炎的發生發展與炎性因子IL-1、IL-8和TNF-α釋放及其相關信號通路激活，抗原呈遞細胞活化，中性粒細胞凋亡和免疫球蛋白等有關[17]。其中炎性因子釋放和相關信號通路異常激活，促進炎性因子的釋放過程中NF-κB是炎性因子自分泌或/和旁分泌的中心環節，JNK對運行炎癥的機制發揮重要的介導作用，因此，本研究以痛風性關節炎為研究基礎，研究不同濃度的豨薟草提取物和JNK信號通路抑制劑SP600125痛風性關節炎炎性因子IL-1、IL-8、TNF-α和NF-κB影響，研究發現模型組中大鼠血清中IL-1、IL-8、TNF-α含量明顯增加，滑膜組織中NF-κB的表達明顯增加，灌胃給予不同濃度的豨薟草提取物和JNK抑制劑SP600 125發現大鼠血清中IL-1、IL-8、TNF-α含量明顯降低，滑膜組織中NF-κB的表達明顯降低，并且結合病理學結果可知模型組滑膜組織中滑膜細胞增生、成纖維細胞增生和炎癥明顯；給予不同濃度的豨薟草和JNK抑制劑SP600125炎性細胞浸潤明顯減少，滑膜細胞增生和成纖維細胞增生明顯減輕，表明豨薟草和JNK抑制劑SP600125能夠明顯改善痛風性關節炎癥狀的發生發展和炎性因子的釋放。

JNK信號通路的激活與許多疾病的發生發展密切相關，本研究發現模型組大鼠滑膜組織中JNK和p-JNK蛋白的表達明顯增加，c-Jun、AP-1mRNA水平表達明顯升高，說明痛風性關節炎激活JNK信號通路，給予不同濃度的豨薟草和JNK抑制劑SP600125能夠明顯降低JNK、p-JNK、c-Jun mRNA和AP-1 mRNA表達水平。

綜上所述，以痛風性關節炎為研究對象，通過觀察不同濃度豨薟草與JNK抑制劑SP600125對痛風性關節炎大鼠血清中IL-1、IL-8、TNF-α含量變化和滑膜組織病理學觀察發現豨薟草和JNK抑制劑SP600125能夠降低痛風性關節炎大鼠血清中IL-1、IL-8、TNF-α水平，降低滑膜組織中炎性因子的釋放和浸潤，改善炎癥反應，同時研究發現痛風性關節炎滑膜組織中JNK和p-JNK蛋白及c-Jun mRNA和AP-1 mRNA表達增加，豨薟草和JNK抑制劑SP600125能夠明顯降低JNK和p-JNK蛋白和c-Jun mRNA和AP-1 mRNA表達，結果表明豨薟草能夠明顯改善痛風性關節炎大鼠炎性反應和滑膜組織損傷，可能的機制是通過改善JNK通路的異常激活，降低JNK通路介導的炎癥反應，因此，豨薟草有望作為JNK信號通路抑制劑成為治療痛風性關節炎藥物。