去卵巢大鼠骨質疏松模型的制備與評價

彭珊 歐陽厚淦 趙志冬 盧文靜 高書亮

江西中醫藥大學，江西 南昌 330004

骨質疏松(osteoporosis，OP)是一種以低骨量，破壞骨微結構，增加骨脆性及骨折風險性增加的骨代謝疾病，分為原發性和繼發性兩種，多由雌激素缺乏及骨鈣下降造成[1]。本實驗通過制備去勢大鼠骨質疏松模型，在去勢后的連續5天對其晨間陰道分泌物進行評價，為更好研究此癥提供基本理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠，雌性，2-3月齡，64只，體重約：180-200 g。

1.2 動物分組與飼養

適應性喂養1周，按照隨機分組數字表將64只雌性大鼠分成兩組，模型組(50只)、正常組(14只)，自然飼養。

1.3 模型制備

模型組行雙側卵巢結扎摘除術：首先10% 水合氯醛(3 mL/)腹腔注射麻醉，剔除長毛，在固定板上俯臥位固定，取大鼠背側切口，即最末肋下、腋中線與距脊柱外側約2處，碘伏消毒切口及周緣皮膚，逐層切開皮膚、內層肌肉約0.5-1，視野中可見一乳白色脂肪團并分離，可見粉紅色或黃紅色卵巢，絲線結扎卵巢根部下的輸卵管并摘除卵巢，逐層縫合肌肉和皮膚，碘伏消毒。同法摘除另一卵巢。術后肌肉注射青霉素(80萬單位，0.1 mL/只)1次/天，連續6天。去勢大鼠，分籠飼養。定期碘伏消毒雙側切口且保持干燥。正常組自然飼養，不做任何處理。

1.4 評價方法

兩組實驗大鼠均于術后次晨(7:00-8:00)開始檢查陰道上皮角化細胞的變化，1次/天，連續5天。左手抓取大鼠，右手利用無菌棉簽進入陰道并輕旋棉簽一圈后順勢輕退，迅速將沾陰道分泌物的棉簽按同一方向置于滴有適量生理鹽水的載玻片上，待其自然風干后滴加甲醇(以覆蓋分泌物為適量)，自然風干，行瑞氏染色，鏡下觀察陰道上皮角化細胞變化，以證明去勢成功。

2 結果

2.1 實驗動物的一般情況

實驗模型制備中有8只大鼠意外死亡，術后模型動物運動量減少，在同等外力下，較制備模型前更易乏力，甚至抽筋、骨折。

2.2 瑞氏染色

箭頭示意：紅色：白細胞；黃色：角化細胞；白色：有核上皮細胞。

圖1 ①模型組：動情間期：白細胞為主，有核上皮細胞少見; ②正常組：動情前期：膨大的角化上皮細胞與有核上皮細胞共存，偶見白細胞;③正常組：動情期：不規則角化上皮細胞聚集，少量有核上皮細胞或白細胞;④正常組：動情后期：三種細胞比例相當;⑤正常組：動情間期：細胞總數少，有核上皮細胞和白細胞共存，角化上皮細胞偶見。Fig.1 ①Model group: Diestrus: leukocytes dominate, nuclear epithelial cells are rare; ②Normal group: Proestrus: Coexistence of dilated cornified epithelial cells with nuclear epithelial cells, with occasional leukocytes;③Normal group: Estrus: Irregular cornified epithelial cells aggregated, small number of nuclear epithelial cells or leukocytes;④Normal group: Metoestrus: The proportion of the three types of cells are comparable;⑤Normal group: Diestrus: The total number of cells is small, coexistence of nuclear epithelial cells and leukocytes, with occasional angular epithelial cells

3 討論

眾所周知，骨質疏松是由各種原因導致骨組織結構破壞，常見破骨細胞活性較成骨細胞活性更強，最終新骨形成減少而骨吸收增多[2]。隨著我國老年人口劇增，患骨質疏松癥的人口日益增加[3]。因此對于骨質疏松的防治研究就迫在眉睫了，而通過動物實驗進行研究是極其重要的一條途徑，其中動物模型的建立又是重中之重。

目前關于骨質疏松癥模型的制備方法繁多，首先從動物的選擇而言，目前包括：大小鼠、家兔、羊、狗、微型豬等，各有優缺點，但制備此模型以大鼠最適，因為小鼠體型小，可取血樣少，微型豬可取血清多，但其體型過大，價格昂貴，卵巢不易切除；骨代謝隨季節而變的食草動物，其雙側卵巢切除后的骨丟失量與人類骨質疏松癥的水平不符或短暫持續，甚至家兔骨密度降低多見軀干骨，而四肢骨未見；去睪丸狗所引起的骨吸收大于骨形成與人類骨質疏松癥的水平相似，而去卵巢狗不能誘導此癥。

其次是誘發骨質疏松癥的方法，主要有離體和在體兩種，以在體中的藥物誘發骨質疏松癥而言，此法有如下劣勢：周期長，造模影響因素繁多，低成功率，低再現性，適用范圍窄，停藥后實驗對象骨質疏松癥可自行修復，與人類雌激素下降的臨床癥狀不符，結果可信度低；而在體中的去甲狀旁腺和下丘腦-垂體切除術均不易操作，周期不確定，易損傷周圍組織，主要以影響腸道對鈣的吸收和神經內分泌功能紊亂誘發骨質疏松癥，目前此法應用較少。

鑒于此，選擇一種既利于操作又具有可信度的模型顯得尤為重要。目前，“去勢大鼠”是美國食品與藥品管理局和世界衛生組織推薦研究雌激素水平下降形成骨質疏松癥的模型，這種模型在研究絕經后婦女發生骨質疏松的病理過程已經得到公認[4, 5]。此類模型優勢在于：大鼠飼養方便，價廉，去勢術簡便，高存活率，高成功率，易重復，易再現，周期短(15天)，適用廣泛，術后表現與人類骨質疏松癥后的骨代謝、骨微結構變化相似，因而最常選擇該法[6]。因此，終上所述，并根據實驗需要，我們也選用該種方法。因3月齡雌性大鼠性腺、內分泌系統均發育成熟以及骨骼系統已形成基本構架，從而本實驗選取此時期的大鼠[7]。

再次，在指標選擇上也存在不同。有研究報道[8]，判斷去勢是否成功時，一般多以實驗動物骨密度(bone mineral density,BMD)、骨強度及生化指標，但是由于年輕的大鼠缺少板層骨，皮質骨缺少哈弗氏系統，并且在卵巢去除后實驗動物生命周期縮短、血量少、不可進行大量的采血取樣以及骨組織的活檢[7, 8]。因此本實驗采用觀察陰道上皮角化細胞非動情周期變化證明去勢成功，此法具有傷害小，簡便，周期短，結果客觀等優勢。研究報道的雌性大鼠動情周期變化[9]與本實驗結果基本相同。動情前期膨大的角化細胞和有核上皮細胞共存；動情期角化細胞聚集成片，而有核上皮細胞或白細胞卻極少；三種細胞均衡時進入動情后期；隨著角化細胞減少，白細胞逐漸增多且為主，即進入動情間期。本實驗連續5天晨間陰道分泌物涂片顯示：模型組均多見白細胞及有核上皮細胞少見，正常組首日以有核上皮細胞為主，白細胞和角化細胞均偶見進入動情前期；隨著有核上皮細胞逐漸轉化成無核角化細胞及有核上皮細胞和白細胞極少見進入動情期；而隨著角化細胞的減少，另兩種細胞的增多，此時三種細胞單位面積比例相當，證明此期為動情后期；最終無核角化細胞極少，白細胞和有核上皮細胞共存后進入動情間期。此四期為連續性周期變化，即：動情前期→動情期→動情后期→動情間期，因而陰道分泌物的上皮角化細胞是漸變的，隨雌激素水平變化而變化。因此根據陰道分泌物涂片中的上皮角化細胞可準確區分動情周期各階段，從而判定去勢是否成功。

因此，通過動物實驗進行骨質疏松研究時，合理選擇實驗動物也極其重要。通過在動物身上模擬人類骨代謝性的變化，才能為人類研究骨質疏松提供可靠的實驗依據，動物模型的研究只是人類研究OP的一種方法或手段，尚不能完全代表人類自身發生該病時的生理病理變化，在實驗前必須根據實驗目的或者實驗內容，查閱大量的文獻，合理選擇制備模型的方法。現骨質疏松模型建立的方法很多，以傳統的誘導性去勢動物模型為優勢，如今通過基因敲除術制備的轉基因動物模型也日益受到關注。盡管如此，骨質疏松動物模型的研究仍然需要更多的研究。