Notch1對肺纖維化小鼠腸黏膜屏障的影響及作用機制研究

郭 慧，劉學軍，杜毓鋒，郝小燕，張 帆，郭娜娜，林白陽

Notch1對肺纖維化小鼠腸黏膜屏障的影響及作用機制研究

郭 慧，劉學軍，杜毓鋒，郝小燕，張 帆，郭娜娜，林白陽

目的 探討Notch1在肺纖維化腸黏膜屏障中的影響及其作用機制。方法 將24只健康雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組(N組)、肺纖維化模型組(I組)、肺纖維化+Notch1抑制組(I+D組)。I組、I+D組氣管內注入博來霉素造模，I+D組在造模后1周開始腹腔注射Notch1抑制劑DAPT。在造模后28 d全部處死小鼠，取小鼠血液、肺臟、回腸末端10 cm。血液離心后的血清用于ELISA測量丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的含量。右肺、5 cm回腸石蠟包埋后采用HE、Masson染色，并測量腸黏膜、腸絨毛以及腸隱窩的高度。PCR測量左肺、5 cm回腸末端的Notch1mRNA含量。結果 小鼠肺部HE染色、Masson染色、Ashcroft評分提示I組存在明顯的纖維化改變，與N組、I+D組比較差異有統計學意義(P<0.05)。I組小鼠腸黏膜厚度、絨毛高度、血清中T-SOD、GSH-PX含量明顯低于N組、I+D組，腸道Chiu’s分級、血清MDA的含量明顯高于N組、I+D組，差異有統計學意義(P<0.05)。表明IPF小鼠腸黏膜上皮細胞完整性被破壞、黏膜損傷。小鼠腸隱窩深度的測量結果提示I組腸隱窩細胞增生明顯高于N組、I+D組，差異有統計學意義(P<0.05)。I組肺組織、腸道組織中Notch1 mRNA的表達高于N組、I+D組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 Notch1表達增高促進了肺纖維化的發生，小鼠肺纖維化體內存在腸黏膜的損傷、壞死脫落，Notch1同時可以通過腸上皮隱窩增生介導腸上皮損傷后修復。

肺纖維化；腸黏膜屏障；Notch1；丙二醛；總超氧化物歧化酶；谷胱甘肽過氧化物酶

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性、進行性和致死性惡性間質性肺疾病[1]。一旦確診，平均生存期3年～5年，且病死率逐年上升，目前病因尚未完全闡明。IPF典型的臨床癥狀是逐漸加重的呼吸困難、低氧血癥，而腸黏膜對缺氧十分敏感。Notch1在肺、腸的發育中呈動態表達，并在調控其細胞的分化、增殖、凋亡中起關鍵作用[2-3]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物以及分組 24只雄性C57BL/6小鼠，SPF級，體重20 g～25 g。將小鼠按照隨機數字表獲得的編號按大小分為3組，每組8只。

1.2 要試劑及儀器 博來霉素(15 mg，日本株式會社)；DAPT(美國selleckchem公司)；Masson染色試劑盒(北京索萊寶)；丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(南京建成)；引物合成(上海生工)；反轉錄試劑盒(TAKARA，大連寶生物)；擴增試劑盒(Vazyme，諾唯贊)。實驗中所用的Scanscope數字病理掃描系統、基因擴增儀、熒光定量PCR儀由山西醫科大學科研中心提供。

1.3 方法

1.3.1 造模及取材 I組及I+D組按5 mg/kg氣管內注入博來霉素。造模1周后，每天將DAPT腹腔注入I+D組，共7 d。造模后28 d后，所有小鼠均處死取材。心臟取血，收集入紫管。離心后，將血清標記，儲存于-80 ℃冰箱。取小鼠左肺、右肺、回盲部上端10 cm腸道組織。左肺、5 cm回腸標記后儲存于-80 ℃冰箱，右肺、5 cm回腸于10%甲醛液中固定，石蠟包埋。

1.3.2 HE、Masson染色 肺臟、腸道的石蠟組織包埋后切片，按標準步驟進行HE染色。Masson染色測定肺部纖維化的程度，按其說明書進行操作。

1.3.3 病理性分析 肺纖維化程度采用Ashcroft評分，共8級。腸黏膜損傷以Chiu’s分級為評分標準，共6級。請兩名病理學工作人員盲評，以評分的均數作為最后得分。

1.3.4 小腸黏膜形態學指標 采用Scanscope數字病理掃描系統測定回腸黏膜、絨毛以及隱窩高度，每個標本測定5個完整黏膜、絨毛以及隱窩高度，取其平均值。

1.3.5 血清MDA、T-SOD、GSH-PX測定 MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，腸黏膜細胞受損、壞死后，可釋放入血，是反映腸黏膜上皮細胞完整性和損傷程度的可靠的生化指標[4-5]。T-SOD、GSH-PX是體內清除氧自由基的重要酶，其減少可間接反映腸黏膜的損傷。

1.3.6 PCR測定血清、肺組織、腸道組織Notch1的表達量 采用酚氯仿的方法提取RNA，利用反轉錄試劑盒在基因擴增儀生成c-DNA，利用擴增試劑盒在熒光定量PCR儀進行擴增，得到CT值，利用2-ΔΔCT計算Notch1在各組間的相對表達量。

2 結 果

2.1 小鼠的一般情況 N組造模后一般情況好，與造模前比較差異無統計學意義。造模后I組小鼠毛發灰暗，食欲下降，活動少，呼吸淺快，偶可聞及喘息。I+D組情況較I組稍好。

2.2 肺組織HE染色、Masson染色，腸道HE染色 N組肺泡結構基本完整，肺泡壁未增厚。I組大量肺泡結構破壞，部分肺泡塌陷融合，肺泡間隔增厚，出現大量寬帶狀及片狀膠原纖維，呈彌漫纖維化改變。I+D組改變較I組輕。提示I組、I+D造模成功，DAPT抑制Notch1減輕肺纖維化。詳見圖 1、圖2。

N組 I組 I+D組

N組 I組 I+D組

N組腸黏膜連續、完好，I組大量腸絨毛及固有膜脫落，同時存在隱窩增生，I+D組改變較I組輕。提示IPF小鼠存在腸黏膜損傷，且損傷后通過隱窩增生以替代壞死的腸絨毛。詳見圖3。

N組 I組 I+D組

2.3 肺部、腸道的病理學分析 I組肺纖維化ashcroft評分為(6.88±0.24)分，提示存在明顯的肺纖維化，伴有肺組織結構的破壞，存在纖維條帶或纖維小結的形成。I組腸黏膜損傷Chiu’s分級為(3.88±0.19)分，提示大片腸黏膜上皮抬高，絨毛向兩側倒伏，部分絨毛頂端脫落。I組ashcroft評分、Chiu’s分級較N組、I+D組高，差異有統計學意義。詳見表1。

表1 各組ashcroft評分、Chiu’s分級比較(±s) 分

2.4 小腸黏膜形態學指標 I組腸黏膜厚度較N組明顯降低，較I+D組輕微減低，差異有統計學意義。I組腸絨毛高度較N組、I+D組降低，差異有統計學意義。結果提示IPF小鼠體內存在腸黏膜的損傷、壞死脫落。I+D組小鼠可能通過抑制Notch1表達減輕肺纖維化程度，腸黏膜缺氧較輕，從而腸黏膜損傷較I組輕。I組隱窩深度較N組、I+D組深，差異有統計學意義。I+D組隱窩細胞深度的顯著降低，提示Notch1在IPF小鼠腸隱窩的增生以修復腸黏膜的損傷中起到重要作用。詳見表2。

表2 各組腸黏膜厚度、絨毛高度、隱窩深度比較(±s) μm

2.5 血清MDA、T-SOD、GSH-PX測定結果 I組MDA含量較N組、I+D組高，T-SOD、GSH-PX含量較N組、I+D組低，差異有統計學意義。提示I組、I+D組存在腸黏膜損傷，I+D組較I組輕。詳見表3。

表3 各組血清MDA、T-SOD、GSH-PX比較(±s)

2.6 小鼠肺、腸道中Notch1mRNA的相對表達量 各組小鼠肺臟、腸道組織的Notch1mRNA表達呈現一致性。I組Notch1的表達較N組、I+D組升高。提示Notch1表達增高促進了IPF的發生，DAPT通過抑制Notch1的表達發揮抗纖維化作用。同時，Notch1在IPF小鼠腸道表達增高，可能介導了IPF腸黏膜損傷后的修復，DAPT也可以抑制腸隱窩細胞增生。詳見表4。

表4 各組小鼠肺、腸道中Notch1mRNA的相對表達量(±s)

3 討 論

Notch1是Notch信號通路的受體蛋白。Notch信號通路與肺部許多常見疾病的發生相關聯，例如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺動脈高壓、肺癌。同時，Notch通路的激活介導肺纖維化的發生。 Aoyagi- Ikeda等[6]研究表明 Notch1通過 TGF-β1- smad3通路誘導肺泡上皮細胞分化形成肌成纖維細胞(EMT)，而 EMT是肺纖維發生的一個主要環節。本實驗通過博來霉素誘導小鼠肺纖維化，并通過DAPT抑制Notch1的表達，證實了Notch信號通路在IPF的發生中發揮關鍵作用。

腸道的機械屏障由腸道黏膜上皮細胞、細胞間緊密連接等構成，能阻擋腸內有害物質如細菌及內毒素穿透腸黏膜進入深部組織。肺部疾病的發生通常伴有腸道形態及功能的改變。Du等[7]研究認為金葡萄球菌肺炎發生時，存在腸道黏膜損傷、腸上皮細胞的凋亡。Li等[8]通過大鼠暴露于香煙煙霧誘導COPD模型中，大鼠全身存在氧化應激和炎癥，通過線粒體凋亡途徑增加腸上皮細胞死亡。同時腸道的氧化應激促進了缺氧誘導因子-1(HIF-1)的活化，從而破壞了腸上皮的緊密連接，增加了腸上皮的滲透性。本實驗通過測量腸黏膜厚度、絨毛長度，Chiu’s評分，血清中MDA、T-SOD、GSH-PX測定，證實了肺纖維化小鼠存在腸黏膜損傷。其機制可能與肺纖維化導致全身慢性缺氧有關。小腸絨毛的解剖結構導致其氧分壓遠低于動脈血，對缺氧十分敏感。腸絨毛缺氧時因代謝障礙導致細胞間連接斷裂、細胞水腫甚至壞死。同時缺氧可激活多種炎癥介質，加劇了腸上皮的毀傷。

Notch信號通路在維持腸上皮穩態發揮關鍵作用。腸上皮是身體中更新最快的組織，其分裂和遷移的干細胞數量主要是隱窩底部細胞，LGR5是腸活性干細胞群體的特異性標記物[9]。Chen等[10]研究提示腸隱窩細胞通過結合Notch1基因的第二個內含子采用正反饋介導腸上皮的再生和干細胞的自我更新。Carulli等[11]研究提示在Notch1缺陷小鼠的在輻射損傷后隱窩增生受損。本實驗通過測量隱窩的深度、PCR證實了Notch1介導了肺纖維化小鼠腸黏膜損傷后的修復。

肺纖維化腸黏膜的改變可能涉及許多信號分子，其組成了一個復雜的網絡系統，本實驗提示Notch1介導腸損傷后的修復。本實驗著重探索腸黏膜機械屏障的改變，肺纖維化的腸黏膜可能存在免疫屏障中IgA分子、生物屏障中菌群的移位等眾多改變，其中的機制需要更進一步的研究。

[1] Liu X，Qian L，Nan H，et al. Function of the transforming growth factor-beta1/c-Jun N-terminal kinase signaling pathway in the action of thalidomide on a rat model of pulmonary fibrosis[J]. Exp Ther Med，2014，7(3)：669-674.

[2] Sander GR，Powell BC. Expression of notch receptors and ligands in the adult gut[J]. J Histochem Cytochem，2004，52(4)：509-516.

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[6] Aoyagi-Ikeda K，Maeno T，Matsui H，et al. Notch induces myofibroblast differentiation of alveolar epithelial cells via transforming growth factor-beta-Smad3 pathway[J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2011，45(1)：136-144.

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[8] Li H，Wu Q，Xu L，et al. Increased oxidative stress and disrupted small intestinal tight junctions in cigarette smoke-exposed rats[J]. Mol Med Rep，2015，11(6)：4639-4644.

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[10] Chen KY，Srinivasan T，Tung KL，et al. A Notch positive feedback in the intestinal stem cell niche is essential for stem cell self-renewal[J].Molecular Systems Biology，2017，13(4)：927.

[11] Carulli AJ，Keeley TM，Demitrack ES，et al. Notch receptor regulation of intestinal stem cell homeostasis and crypt regeneration[J]. Dev Biol，2015，402(1)：98-108.

(本文編輯郭懷印)

山西省自然科學基金面上項目(No.201601D011105)

山西醫科大學第一醫院(太原 030001)

劉學軍，E-mail：lxj20041205@sina.com

信息：郭慧，劉學軍，杜毓鋒，等.Notch1對肺纖維化小鼠腸黏膜屏障的影響及作用機制研究[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(13)：1572-1575.

R563 R259

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.13.009

1672-1349(2017)13-1572-04

2017-02-18)