高海拔地區骨髓源神經干細胞及BDNF聯合移植對大鼠腦缺血再灌注模型的治療

陳曉娟 肖宗宇 侯倩 才鼎

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·論 著·

高海拔地區骨髓源神經干細胞及BDNF聯合移植對大鼠腦缺血再灌注模型的治療

陳曉娟 肖宗宇 侯倩 才鼎

目的 探討高海拔地區大鼠骨髓源神經干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells，BMSCs-NSCs)及腦源性神經生長因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)聯合移植對大鼠腦缺血再灌注模型的療效及其相關機理。方法 60只Wistar雄性大鼠，置西寧地區正常飼養，制備大鼠腦缺血-再灌注損傷模型；模型制備完畢后立體定向下進行細胞移植治療，將大鼠分為3組，即A組：大鼠骨髓源性神經球組(BMSCs-NSCs組，n=20)；B組：大鼠骨髓源性神經球聯合BDNF組(BMSCs-NSCs+BDNF組，n=20)，注射大鼠骨髓源性神經球細胞的同時，聯合注射100 ng BNDF；C組：對照組(僅注射DMEM/F12培養基，n=20)；術后對其神經功能進行評定，并于術后24 d取腦組織，行Nestin、GFAP、Map2免疫熒光檢測。結果 細胞移植后第3 d，各組間神經功能評分無顯著性差異；細胞移植后第14 d BMSCs-NSCs+BDNF組神經功能評分顯著優于BMSCs-NSCs組，BMSCs-NSCs組優于對照組；免疫組化檢測發現，BMSCs-NSCS+BDNF組Nestin、GFAP、Map2的IOD值均顯著高于BMSCs-NSCs組；BMSCs-NSCs+BDNF組、BMSCs-NSCs組各檢測指標水平均高于對照組；Nestin、GFAP、Map2的表達主要集聚于腦梗死灶與正常腦組織交界處。結論 在西寧地區聯合移植大鼠骨髓源神經干細胞及BDNF可顯著促進大鼠大腦中動脈閉塞再灌注損傷模型的神經功能恢復。

骨髓基質干細胞 神經干細胞 骨髓源神經干細胞 腦源性神經營養因子 高海拔

近年來，隨著神經干細胞(neural stem cells，NSCs)研究的不斷深入，部分研究者將骨髓基質細胞( bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成功誘導培養出了骨髓源神經干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells，BMSCs-NSCs)。腦源性神經生長因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是一種具有防止神經元死亡功能的蛋白質，在體外它可保持NSCs的活性和促進其向神經元分化[3-4]。為探討在高海拔地區大鼠BMSCs-NSCs細胞移植對大鼠腦閉塞-再灌注損傷模型的療效，本研究擬在西寧地區(平均海拔約2200米)制備Wistar大鼠大腦中動脈閉塞-再灌注損傷模型，并在立體定向下進行顱內細胞移植，觀察BMSCs-NSCs及BDNF聯合移植對大鼠腦缺血再灌注模型的療效，并初步探討其相關機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠共60只，平均體重(200±20) g，購自蘭州大學實驗動物中心，合格證號為SCXK(甘)2013-0002。

1.2 試劑

DMEM/F12培養基、0.25%胰蛋白酶由Gibco公司購得。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)為Hyclone公司產品。B27添加劑購自Invitrogen公司。表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及腦源性神經生長因子(BDNF)由Peprotech公司購得，小鼠抗Nestin抗體、兔抗GFAP抗體、小鼠抗Galc抗體為Chemicon公司產品，兔抗CD133抗體購自Santa Cruz公司，小鼠抗Map2抗體、兔抗β-tubulin III抗體由Abcam公司生產。Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor 594標記羊抗兔IgG和Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG由Molecular Probes公司生產。DAPI封片劑為Vector Laboratories公司產品。

1.3 大鼠骨髓源神經干細胞的培養及鑒定

選取成年雄性Wistar大鼠，無菌條件下取雙側股骨和肱骨，反復沖洗骨髓腔，收集骨髓組織懸液，以含10%FBS的DMEM/F12進行培養；收集生長狀態良好的BMSCs，經0.25%胰酶消化，制備單細胞懸液，以含20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF及1∶50的B27添加劑的DMEM/F12無血清培養基重懸，接種密度為2×105細胞/ mL，隔天換半液1次并添加相應劑量生長因子；收集在無血清培養條件下形成的神經球，采用免疫熒光法檢測神經干細胞特異性標志物CD133和Nestin。

1.4 大鼠大腦中動脈閉塞再灌注損傷模型的建立

參考Longa等[5]的報道，采用3.6%水合氯醛對大鼠按1mL/100g體重的劑量進行腹腔注射麻醉后取仰臥位固定于手術臺上，分離右側頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈，結扎并剪斷頸外動脈遠端，經頸外動脈向頸內動脈插入線栓，阻斷大腦中動脈血供，缺血2 h后拔除線栓，成功制備大腦中動脈閉塞再灌注損傷模型。

1.5 大鼠腦缺血再灌注模型的治療

成功制備大鼠腦缺血再灌注模型后第3 d，將各大組大鼠分為3組，即A組：大鼠骨髓源性神經球組(BMSCs-NSCs組，n=20)；B組：大鼠骨髓源性神經球聯合BDNF組(BMSCs-NSCs-BDNF組，n=20)，注射大鼠骨髓源性神經球細胞的同時，聯合注射100ng BNDF；C組：對照組(僅注射DMEM/F12培養基，n=20)；收集BMSCs-NSCs，并調整活細胞密度為5×105/10 μL DMEM/F12培養基；將大鼠顱平位固定于立體定向儀，選右側大鼠腦尾狀核為接種靶點，其坐標為前囟中點前1.0 mm，矢狀縫右旁開3.0 mm，硬膜下5.0 mm，對各組大鼠進行顱內細胞移植治療；分別于細胞移植治療后第3、7、14、21 d，采用行走測試對各組大鼠進行神經功能評分，1分為能直線行走；2分為不能直線行走；3分為因癱瘓，只能原地旋轉；4分為因癱瘓，不能動；細胞移植治療后21 d，收集各組大鼠，對腦組織切片行Nestin、GFAP、Map2免疫組化檢測，收集圖片，利用IPP(Image Pro-Plus)對圖片進行分析，測量陽性細胞的總光密度(Integrated Optical Density，IOD)值。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 大鼠骨髓源神經干細胞的培養及鑒定

將大鼠BMSCs轉入含20 ng/mLbFGF、20 ng/mLEGF及B27添加劑(1∶50)的DMEM/F12培養基后呈懸浮球狀聚集生長。經免疫組織化學檢測，所形成的細胞球呈CD133和Nesitn陽性(圖1)。

圖1 大鼠骨髓源神經干細胞呈Nestin(綠色、圖A)、CD133(紅色、圖B)陽性，細胞核以DAPI復染(藍色、圖C)，熒光顯微鏡，標尺為50μm

2.2 各組神經功能評定

細胞移植內7 d行神經功能評定，各組間無顯著性差異(P>0.05)；細胞移植14 d后， BMSCs-NSCs+BDNF組神經功能評分優于BMSCs-NSCs組，BMSCs-NSCs組優于對照組(P<0.05)；隨時間的推移，對照組的神經功能也有一定程度的恢復。

2.3 各組腦組織免疫組化檢測

于顱內細胞移植術后第21 d取大鼠腦組織，行免疫熒光檢測腦梗塞病灶內Nestin、GFAP、Map2表達情況，行總光密度值檢測，發現BMSCs-NSCs+BDNF組Nestin、GFAP、Map2的IOD值均顯著高于BMSCs-NSCs組；BMSCs-NSCs+BDNF組、BMSCs-NSCs組各檢測指標水平均高于對照組。對照組中MAP2表達為陰性，且BMSCs-NSCs+BDNF組、BMSCs-NSCs組中Nestin、GFAP、Map2的表達主要集聚于腦梗死灶與正常腦組織交界處(圖2～4，表2)。

表1 行走測試比較，分)

圖2 Nestin表達情況 A為BMSCs?NSCs+BDNF組；B為BMSCs?NSCs組；C為對照組

圖3 GFAP表達情況 A為BMSCs?NSCs+BDNF組；B為BMSCs?NSCs組；C為對照組

圖4 Map2表達情況 A為BMSCs?NSCs+BDNF組；B為BMSCs?NSCs組；C為對照組

表2 細胞移植治療后第21 d，各組中 Nestin、Map2、GFAP表達率

注：3組間Nestin、Map2、GFAP IOD值比較有明顯差異(P<0.05)

3 討 論

神經干細胞 (neural stem cells，NSCs)是指分布于神經系統的具有無限增殖、自我更新及多向分化潛能的細胞，作為一種后備儲備，它在一定條件下可以進行增殖、遷移和分化并參與神經系統損傷修復或細胞正常死亡的更新。但是成體中樞神經損傷后其自我再生能力有限，遠遠不能完成神經功能的再生修復，特別是大面積受損的中樞神經組織僅靠自身的神經干細胞修復無法實現。如何促進顱腦損傷后神經再生和神經功能恢復是當前研究的熱點和難點[6-7]。近年來，研究表明骨髓基質細胞于體外通過誘導分化可獲得骨髓源性神經干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells，BMSCs- NSCs)[1-2]。BMSCs- NSCs的成功培養避免了神經干細胞或胚胎干細胞等其它干細胞涉及的來源有限、取材困難、免疫排斥、倫理等問題。因此，BMSCs- NSCs在應用神經干細胞治療人類某些神經系統疾病及損傷方面具有良好的臨床應用前景。

BDNF是一種具有防止神經元死亡功能的蛋白質。BDNF-mRNA廣泛地存在于中樞神經系統和外周組織內。在中樞其廣泛分布在大部分腦區如上丘、大腦皮層和海馬等。BDNF在體外可保持NSCs的活性和促進其向神經元分化。體內外研究均表明，BDNF可顯著增加神經干細胞或神經前體細胞分化為神經元的數量[8-9]。因此，本研究選用BDNF，擬通過聯合移植大鼠骨髓源性神經干細胞和BDNF，增加骨髓源性神經干細胞分化為神經元的數量，改善腦梗死大鼠的神經功能。

西寧地區屬于高海拔地區，市區海拔約2200米，空氣稀薄，含氧量較平原地區為低，人們長期處于一個低壓低氧刺激的環境，對缺血、缺氧耐受力相對較強，高海拔地區人群可能具有更強的腦保護力，在發生腦缺血再灌注損傷時可能會有更小的梗死體積和更輕的臨床癥狀[10]。為明確在高海拔地區進行腦組織缺血再灌注損傷的細胞移植的療效如何？本研究設計了該實驗。本實驗發現，在MACO/R模型細胞移植后第21 d，BMSCs-NSCs+BDNF組的神經功能恢復顯著優于BMSCs-NSCs組及對照組；且顱內表達Nestin陽性細胞顯著高于BMSCs-NSCs組，這些標志物的表達主要集中于細胞移植區及腦梗死病灶與正常腦組織交界處。本研究推測，骨髓源神經干細胞移植入顱內后繼續增殖并分化，在細胞移植治療后第21 d，在移植區仍有大量神經干細胞存活，且BMSCs-NSCs+BDNF組表達Nestin比例更高，表明BDNF促進了神經干細胞在體內的存活及增殖。BMSCs-NSCs+BDNF組神經元(Map2)、星形膠質細胞(GFAP)表達率均顯著高于BMSCs-NSCs組，而對照組中無Map2表達，表明添BDNF后骨髓源神經干細胞顯著促進了骨髓源神經干細胞向神經元及星形膠質細胞分化的比例。結合神經功能評分，聯合移植治療顯著改善了大鼠腦缺血—再灌注損傷模型的神經功能。由此可見，BDNF顯著增強了骨髓源神經干細胞移植治療的療效，其可能機制如下：①在BDNF的影響下一部分神經干細胞分化神經元，促進了神經功能的恢復；②神經干細胞或已分化的星形膠質細胞、神經元等分泌多種細胞因子，促進神經的再生；③神經干細胞分化為少突膠質細胞，參與了神經細胞髓鞘的形成，促進了神經纖維的生長，促進了神經功能的恢復。

此外，本研究發現無論細胞移植組或對照組，在腦梗死病灶及正常腦組織邊界仍有部分細胞表達Nesin，由此可推測此部分神經干細胞可能來源于自體神經干細胞，在機體中樞神經系統損傷時自體神經干細胞參與了神經系統損傷的修復。雖然對照組中在腦梗死區中無Map2的表達，但在腦梗死病灶與正常腦組織邊緣有大量GFAP陽性細胞表達。從神經功能評分來看，隨著時間推移，對照組大鼠神經功能也有一定程度的恢復，由此本研究推測其神經功能的恢復可能來源于自體神經干細胞，也可能系腦梗死后病灶周圍大量表達GFAP的膠質細胞增殖、釋放神經生長因子等促進了神經功能的恢復。

綜上所述，在高海拔地區聯合移植大鼠骨髓源神經干細胞及BDNF可顯著促進大鼠大腦中動脈腦閉塞—再灌注損傷模型的神經功能恢復，但其潛在機制仍需進一步研究。

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(2016-06-26收稿)

The effects of BDNF on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells in high altitude

ChenXiaojuan,XiaoZongyu,HouQian,etal.

*DepartmentofNeurology,People’sHospitalofQinghaiProvince,Xining810000

Objective To investigate the efficacy of neural stem cells derived bone marrow to repair rats MACO/R model in high altitude, and to discuss the mechanism.Methods 60 Wistar rats were prepared for MACO/R model in Xining, then neural stem cells derived from bone marrow were injected in the right striatum. And these rats were randomly divided into three groups: A: BMSCs-NSCS group (n=20), B: BMSCs-NSCS+BDNF group (n=20), C: control group (n=20). Then neurological scales were tested, the expression of Nestin, GFAP, Map2 were tested by Immunochemistry. Results There was no significance difference in neurological scales in different groups in day 3. The neurological function was recovered after cell therapy, and the neurological function was better in BMSCs-NSCs+BDNF group. The expression of Nestin, GFAP, Map2 were much higher in BMSCs-NSCS+BDNF group than BMSCs-NSCS groups and control group. And the Expression of MAP2, β-tubulin, GFAP, CD133, Nestin were gathered in the injection area and the conjunction area between the normal brain tissue and the cerebral infarction.Conclusion Transplantation of BMSCs-NSCS and BDNF could significantly promote the recovery of neurological function in MACO/R model in Xining area.

Bone marrow mesenchymal stem cells Neural stem cells Bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells BDNF High altitude

青海省科技創新能力促進計劃項目(編號為2015-ZJ-943Q)

810000 西寧，青海省人民醫院神經內科(陳曉娟 侯倩 才鼎)；青海大學附屬醫院神經外科(肖宗宇)

R743.3

A

1007-0478(2017)02-0087-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.02.001