抗帕顆粒對(duì)帕金森病模型小鼠酪氨酸羥化酶神經(jīng)元的影響

趙曉暉 朱玉萍 楊娟 劉慧琴 沈建

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·論 著·

抗帕顆粒對(duì)帕金森病模型小鼠酪氨酸羥化酶神經(jīng)元的影響

趙曉暉 朱玉萍 楊娟 劉慧琴 沈建

目的 探討抗帕顆粒對(duì)1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)帕金森病(PD)模型小鼠黑質(zhì)紋狀體酪氨酸羥化酶(TH)陽(yáng)性神經(jīng)元的影響。方法 90只健康雄性C57BL/6小鼠，鼠齡8～12周，并隨機(jī)分為3組，即正常對(duì)照組30只、PD模型對(duì)照組30只、PD模型干預(yù)組30只；MPTP腹腔注射(40 mg·kg-1·d-1×7 d)制備小鼠PD模型；正常對(duì)照組及PD模型對(duì)照組予生理鹽水1 mL·d-1灌胃，PD模型干預(yù)組給予抗帕顆粒40 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)喂養(yǎng)4個(gè)月；黑質(zhì)紋狀體切片、HE染色、免疫組織化學(xué)染色TH神經(jīng)元及Western blotting檢測(cè)TH蛋白的表達(dá)量。結(jié)果 ①正常對(duì)照組30只(30/30只)最終均存活，PD模型對(duì)照組4個(gè)月存活27只(27/30只)，PD模型干預(yù)組4個(gè)月存活28只(28/30只)；②PD模型對(duì)照組、PD模型干預(yù)組小鼠每次注射MPTP后先有短暫興奮[持續(xù)(7.61±2.17)min]，表現(xiàn)為四處竄跳，隨即出現(xiàn)全身中重度震顫，皮毛及尾巴時(shí)有豎立，活動(dòng)減少，持續(xù)(24.23±3.89)min后震顫消失，隨后出現(xiàn)活動(dòng)減少；③HE染色顯示正常對(duì)照組大量褐色TH陽(yáng)性細(xì)胞，PD模型對(duì)照組TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，PD模型干預(yù)組TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有所增加；④免疫組織化學(xué)染色后經(jīng)Imagepro-Plus 5.1系統(tǒng)分析，正常對(duì)照組TH陽(yáng)性細(xì)胞面積為64 145 μm2，高倍鏡下可見(jiàn)大量胞質(zhì)為褐色顆粒的TH陽(yáng)性細(xì)胞；PD模型對(duì)照組TH陽(yáng)性細(xì)胞染色面積為40 012 μm2，高倍鏡下見(jiàn)TH細(xì)胞數(shù)明顯減少；PD模型干預(yù)組TH陽(yáng)性細(xì)胞染色面積為60 952 μm2，高倍鏡下見(jiàn)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較PD模型對(duì)照組增加；⑤Western blotting檢測(cè)顯示正常對(duì)照組TH蛋白表達(dá)量與PD模型對(duì)照組和PD模型干預(yù)組比較均有明顯差異(P<0.001)，PD模型對(duì)照組TH蛋白表達(dá)量與PD模型干預(yù)組比較也有明顯差異(P<0.05)。結(jié)論 抗帕顆粒可使PD小鼠黑質(zhì)紋狀體中多巴胺能神經(jīng)元一定程度地減少丟失，對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量、形態(tài)及功能具有一定的保護(hù)作用。

帕金森病 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶 小鼠模型 抗帕顆粒 酪氨酸羥化酶陽(yáng)性神經(jīng)元

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是神經(jīng)系統(tǒng)第二大慢性退行性疾病，近年來(lái)中醫(yī)藥在PD中的治療作用日益受到關(guān)注。本研究應(yīng)用名老中醫(yī)傳統(tǒng)用來(lái)治療腦卒中中痰、半身癱瘓、手足痙攣的經(jīng)驗(yàn)方藥抗帕顆粒，分析其現(xiàn)代藥理具有抗氧化應(yīng)激、抗自由基及提高免疫功能等作用[1]；建立1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine,MPTP)致C57BL/6小鼠PD模型[2]；觀察抗帕顆粒對(duì)PD小鼠黑質(zhì)紋狀體酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)陽(yáng)性神經(jīng)元的影響。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康C57BL/6小鼠90只，雄性，鼠齡8～12周，體質(zhì)量20～22 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司供應(yīng)，許可證編號(hào)為SCXK(滬)2013-0016；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由上海交通大學(xué)附屬上海市第六人民醫(yī)院動(dòng)物中心喂養(yǎng)，許可證編號(hào)為SYXK(滬)2011-0128；均飼養(yǎng)于20～25 ℃環(huán)境中，相對(duì)濕度40%～70%，工作照度150～300 Ix，動(dòng)物照度15～20 Ix，12 h晝夜節(jié)律喂養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 抗帕顆粒由江蘇省南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院提供[批準(zhǔn)文號(hào)為通制劑(2001)02-050]，MPTP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG及ABC Kit購(gòu)自Vector公司，DAB-H2O2購(gòu)自武漢博士德公司，兔抗大鼠TH單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Chemicon公司，小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗及HRP標(biāo)記的羊抗小鼠Ⅱ抗購(gòu)自Boster公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 90只上述健康C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組，即正常對(duì)照組30只、PD模型對(duì)照組30只、PD模型干預(yù)組30只。正常對(duì)照組及PD模型對(duì)照組予生理鹽水1 mL·d-1灌胃，PD模型干預(yù)組給予抗帕顆粒(濃度800 mg·mL-1)按40 mg·kg-1·d-1灌胃，每日上午9∶00～10∶00給藥，每周稱(chēng)體重1次，按體重調(diào)整給藥量，連續(xù)喂養(yǎng)4個(gè)月。

正常對(duì)照組30只最終均存活；PD模型對(duì)照組4月存活27只，其中1只背部皮膚被同籠小鼠咬傷感染于第92 d死亡，另2只進(jìn)食逐漸減少，分別于第102 d、114 d衰竭死亡；PD模型干預(yù)組4月存活28只，均為進(jìn)食逐漸減少，于第102 d、119 d衰竭死亡。

1.2.2 PD小鼠模型制備 對(duì)照組生理鹽水0.1 mL/只，腹腔注射，1次/d，連續(xù)7 d；PD模型對(duì)照組予MPTP腹腔注射，注射劑量40 mg·kg-1·d-1×7 d；PD模型干預(yù)組予MPTP腹腔注射，注射劑量40 mg·kg-1·d-1×7 d[2]。

1.2.3 黑質(zhì)紋狀體切片制備 喂養(yǎng)4個(gè)月后每組中隨機(jī)取一半小鼠即正常對(duì)照組15只，PD模型對(duì)照組13只，PD模型干預(yù)組14只腦組織被用于制作切片；將實(shí)驗(yàn)小鼠以麻醉劑(Kentamine 100 mg·kg-1，Xylaxine 10 mg·kg-1，i.p)深度麻醉，經(jīng)心臟依次灌注生理鹽水20 mL和多聚甲醛30 mL；灌注完畢后將小鼠斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中4 ℃條件下后固定24 h；依次浸入15%、20%和30%蔗糖溶液中4 ℃過(guò)夜后入包埋劑O.C.T中冰凍包埋；將小鼠腦切至25 μM厚切片，隔5片取一片，入PBS(0.01 mol·L-1)中4 ℃保存。

1.2.4 TH神經(jīng)元HE染色 用二甲苯去蠟(經(jīng)2次)5～10 min；無(wú)水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各1～2 min，然后蒸餾水洗3 min；蘇木紫液染色約10 min(視染液種類(lèi)和著色情況增減)；水洗，1%酸性乙醇(鹽酸1 ml，70%乙醇99 mL)或1%鹽酸分化，顯微鏡下控制；流水浸洗至少15 min，至細(xì)胞核呈藍(lán)色，也可短時(shí)水洗后浸于40 ℃溫水使核變藍(lán)；顯微鏡下觀察若核染色過(guò)深或不足，應(yīng)再分化或重染；伊紅液染1～2 min后用95%乙醇2次，無(wú)水乙醇2次，每次約1～2 min；苯酚、二甲苯(1∶3)5 min；二甲苯2次，每次3～5 min；中性樹(shù)膠蓋片封片。

1.2.5 TH免疫組織化學(xué)染色 切片經(jīng)0.01 mol·L-1的PBS漂洗10 min后移入抗體稀釋液包被4 h,再予0.01 mol·L-1PBS漂洗3次(每次10 min)后加入R-TH抗體，4 ℃冰箱內(nèi)孵育72 h；PBS同法再漂洗3次，移入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG 4 ℃冰箱中孵育48 h；PBS同法再漂洗3次，移入ABC溶液4 ℃孵育24 h；PBS漂洗3次，每次5 min，DAB-H2O2染色；將切片貼于載玻片上，干燥后脫水透明封片；TH抗體工作濃度1∶5 000，生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG及ABC Kit工作濃度1∶200；應(yīng)用Imagepro-Plus 5.1系統(tǒng)分析小鼠腦黑質(zhì)紋狀體TH染色細(xì)胞形態(tài)及面積。

1.2.6 用Western blotting 檢測(cè)TH蛋白的表達(dá)量 喂養(yǎng)4個(gè)月后每組中取余下另一半小鼠即正常對(duì)照組15只、PD模型對(duì)照組14只、PD模型干預(yù)組14只腦組織被用于提取蛋白；經(jīng)麻醉和冰鹽水等灌注后斷頭取腦，冠狀位切出包含黑質(zhì)的腦組織(前囟尾側(cè)4.6～6.2 mm)，然后進(jìn)行勻漿裂解、離心，保留上清于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

把已提取的蛋白解凍后測(cè)定樣品的總蛋白含量；每泳道加總蛋白20 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，封閉液封閉3 h，4 ℃孵育兔抗大鼠TH單克隆抗體(1∶500)過(guò)夜，室溫下分別孵育HRP標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶1 000)及HRP標(biāo)記的羊抗小鼠Ⅱ抗(1∶1 000)1 h，X線膠片曝光1～10 min，顯影、定影；為了證實(shí)每個(gè)泳道總蛋白量相等，用剝脫液洗膜后以小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(1∶500)孵育4 ℃過(guò)夜，并以HRP標(biāo)記的羊抗小鼠Ⅱ抗(1∶1 000)室溫下孵育1 h，X線膠片曝光1～10 min，顯影、定影；用天能化學(xué)發(fā)光掃描儀對(duì)PVDF膜進(jìn)行掃描；利用Image J軟件分析條帶吸光度，用GraphPad 6.0進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠造模情況

PD模型對(duì)照組、PD模型干預(yù)組小鼠每次注射MPTP后先有短暫興奮[持續(xù)(7.61±2.17)min]，表現(xiàn)為四處竄跳隨即出現(xiàn)全身中重度震顫，皮毛及尾巴時(shí)有豎立，活動(dòng)減少，持續(xù)(24.23±3.89)min后震顫消失，隨后出現(xiàn)活動(dòng)減少，并于各時(shí)間點(diǎn)以爬桿實(shí)驗(yàn)、懸掛實(shí)驗(yàn)、游泳實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)評(píng)分顯示，制模后15 d開(kāi)始正常對(duì)照組與PD模型對(duì)照組比較各評(píng)分均有明顯差異(P<0.05)，至4個(gè)月2組比較各評(píng)分仍有明顯差異(P<0.05)。(表1～3)

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)爬桿實(shí)驗(yàn)得分,分)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；△P>0.05;與PD模型對(duì)照組比較，▲P>0.05,#P<0.05

2.2 各組小鼠黑質(zhì)紋狀體TH神經(jīng)元HE染色情況見(jiàn)圖1。

2.3 各組小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)TH免疫組化染色情況見(jiàn)圖2。

2.4 各組小鼠腦黑質(zhì)紋狀體TH蛋白含量見(jiàn)圖3。

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)懸掛實(shí)驗(yàn)得分,分)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；△P>0.05;與PD模型對(duì)照組比較，▲P>0.05,#P<0.05

表3 各組各時(shí)間點(diǎn)游泳實(shí)驗(yàn)得分,分)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；△P>0.05;與PD模型對(duì)照組比較，▲P>0.05,#P<0.05

圖1 TH神經(jīng)元HE染色

圖2 TH免疫組織化學(xué)染色

注:Control為正常對(duì)照組;Model為模型對(duì)照組;Drug為模型干預(yù)組;A為各組小鼠TH蛋白含量變化;B為各組小鼠TH蛋白光密度定量分析;與模型對(duì)照組比較,*P<0.05;與正常對(duì)照組比較,△P<0.001圖3 Westernblotting檢測(cè)TH蛋白表達(dá)量

3 討 論

帕金森病(PD)是一種以震顫、強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)減少為主要臨床表現(xiàn)的中老年人常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，隨著PD的進(jìn)展，輕者可喪失工作能力，重者生活不能自理，甚至出現(xiàn)抑郁、癡呆、完全喪失運(yùn)動(dòng)功能等。因此，PD已成為我國(guó)乃至世界各國(guó)面臨的重大醫(yī)學(xué)和社會(huì)問(wèn)題。

迄今為止，醫(yī)學(xué)上還沒(méi)有預(yù)防或治愈帕金森病的方法。左旋多巴作為治療PD藥物治療的首選，在疾病早期可使患者的運(yùn)動(dòng)癥狀得到有效控制，遺憾的是左旋多巴的治療并不能改變神經(jīng)元變性的進(jìn)展過(guò)程，并且長(zhǎng)期使用可出現(xiàn)療效減退及副作用等問(wèn)題[1-2]，因此PD患者亟需更多更全面的治療來(lái)有效阻斷或延緩神經(jīng)元的死亡。

PD的主要病理改變是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元選擇性變性丟失，目前關(guān)于神經(jīng)元選擇性退行性變的原因，主要的學(xué)說(shuō)有氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙等。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，PD患者腦黑質(zhì)中固醇類(lèi)過(guò)氧化物比正常人增加10倍[3]。近年來(lái)隨著對(duì)中醫(yī)藥研究的深入，中醫(yī)藥在PD中的治療作用日益受到關(guān)注。本研究應(yīng)用的抗帕顆粒由熟地、山萸肉、紅參、生黃芪、丹參、水蛭、全蝎、僵蠶等8味中藥組成，現(xiàn)代藥理分析顯示抗帕顆粒中熟地能調(diào)節(jié)谷氨酸/γ-氨基丁酸系統(tǒng)遞質(zhì)與受體水平，維持中樞興奮性與抑制性氨基酸功能的協(xié)調(diào)平衡，同時(shí)可降低腦線粒體單胺氧化酶活性，降低體內(nèi)過(guò)氧化脂含量，具有一定的抗自由基作用[4]。山萸肉能明顯抑制二磷酸腺苷、花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集，同時(shí)可抑制白介素-2的產(chǎn)生和表達(dá)[5]。紅參中的人參皂甙有促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)、清除自由基等作用，并可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激來(lái)對(duì)抗多巴胺所誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞凋亡[6]。生黃芪能提高網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，增加抗體分泌細(xì)胞及T、B淋巴細(xì)胞，提高NK細(xì)胞活性，具有增強(qiáng)免疫的作用[7]。丹參成分中的丹參酮類(lèi)、丹參素、丹酚酸類(lèi)化合物等具有很強(qiáng)的抗氧化、抑制炎癥因子、抗氧自由基功能[8-9]。水蛭有較強(qiáng)的抗凝與抗血栓作用,并可減少血小板源生長(zhǎng)因子等重要炎癥因子的產(chǎn)生，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2的表達(dá)起到抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用[10]。僵蠶通過(guò)其所含的草酸胺具有催眠與抗驚厥作用，并可提高機(jī)體免疫力[11]。全蝎可促進(jìn)乙酰膽堿的釋放，并通過(guò)調(diào)節(jié)血栓素B2和6-酮-前列腺素F1α的平衡，起到保護(hù)血管內(nèi)皮、預(yù)防血栓的作用[12]。從以上藥理分析看到，抗帕顆粒具有抗氧化應(yīng)激、抗自由基及提高免疫功能等作用，推測(cè)這種神經(jīng)元保護(hù)作用很可能在PD治療中起重要作用。

TH為多巴胺(dopamine,DA)合成的限速酶，黑質(zhì)紋狀體其蛋白含量及活性降低是發(fā)病的主要原因，在黑質(zhì)水平面上連續(xù)冰凍切片之后行TH神經(jīng)元HE、免疫組織化學(xué)染色，觀察TH陽(yáng)性神經(jīng)元并計(jì)數(shù)，是評(píng)價(jià)PD病理改變的主要方法，被認(rèn)為是PD的直接指示劑[13-14]。本研究結(jié)果顯示，PD模型對(duì)照組黑質(zhì)紋狀體TH陽(yáng)性神經(jīng)元較正常對(duì)照組明顯稀疏，數(shù)量明顯減少；高倍鏡下神經(jīng)元胞體變小，胞質(zhì)染色變淺，細(xì)胞數(shù)量減少，突起變短，說(shuō)明制模有效成功。PD模型干預(yù)組黑質(zhì)紋狀體TH陽(yáng)性神經(jīng)元較PD模型對(duì)照組顯著增多，顯示抗帕顆粒對(duì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元損害有明顯的改善作用；同時(shí)運(yùn)用Western blotting檢測(cè)顯示，正常對(duì)照組TH蛋白的表達(dá)量與PD模型對(duì)照組比較有明顯差異(P<0.001)，說(shuō)明模型復(fù)制成功；PD模型對(duì)照組TH蛋白的表達(dá)量與PD模型干預(yù)組比較也有明顯差異(P<0.05)，提示抗帕顆粒干預(yù)可提高PD小鼠的黑質(zhì)紋狀體TH蛋白的陽(yáng)性表達(dá)水平，對(duì)PD多巴胺神經(jīng)元具有保護(hù)作用，而正常對(duì)照組TH蛋白的表達(dá)量與PD模型干預(yù)組比較也有明顯差異(P<0.001)，顯示抗帕顆粒干預(yù)PD雖有效，但仍不能顯著改善至正常，分析可能與PD為神經(jīng)系統(tǒng)退行性、變性疾病的特性有關(guān)，同時(shí)說(shuō)明中藥治療的局限性，并提示在下一步的研究中需適當(dāng)延長(zhǎng)干預(yù)時(shí)間作進(jìn)一步的研究。

綜上所述，抗帕顆粒可使PD小鼠黑質(zhì)紋狀體中多巴胺能神經(jīng)元一定程度地減少丟失，對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量、形態(tài)及功能具有一定的保護(hù)作用，阻斷氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是這種保護(hù)作用的關(guān)鍵機(jī)制，但還有待于擴(kuò)大樣本、延長(zhǎng)干預(yù)時(shí)間作進(jìn)一步跟蹤研究，并有望在臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

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(2016-06-08收稿)

Effect of anti-Parkinson granule on TH positive-neurons in model mice with Parkinson disease

ZhaoXiaohui,ZhuYuping,YangJuan,etal.

DepartmentofNeurology,thePeople’sHospitalofPudong,Shanghai201200

Objective To explore the pharmaceutical effect of anti-Parkinson granule on substantia nigra and striatum Tyrosine hydroxylase(TH)-positive neurons in model mice with Parkinson disease(PD) induced by 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP).Methods 90 healthy male C57BL/ 6 mice,aged from 8 to 12 weeks,were randomly divided into 3 groups(n=30): normal control group,PD model control group and PD model intervention group.The PD model group was made through intraperitoneal injection with MPTP(40 mg·kg-1·d-1×7 d).The normal control group and the PD model control group were treated with normal saline (1 mL·d-1) intragastrically.The PD model intervention group was treated with anti-Parkinson granule solution(40 mg·kg-1·d-1) intragastrically for 4 months.TH protein expression was detected by HE staining,and immunohistochemistry staining of Western blotting in substantia nigra and striatum slices.At the end of the forth month,TH-positive neurons in substantia nigra and striatum among groups was contrasted and analyzed.Results ①30 mice(30/30 mice)were living in the normal control group,27 mice(27/30 mice)in the PD model control group,and 28 mice(28/30 mice)in the PD model intervention group; ②After injection with MPTP,mice in the PD model control group and the PD model intervention group had short excitements[continued(7.61±2.17)min] with jumping around,followed with the whole body's moderate or severe tremors,fur and tails erected timely and less movement.Tremors ceased after (24.23±3.89)min,and then the movement became less; ③HE staining showed a large number of brown TH positive cells in the control group,the number of PD model control group was significantly reduced,and the number of TH positive cells in the PD model group increased significantly; ④After analysis by Imagepro-Plus 5.1 system,TH positive cells in the normal control group ranged 64 145 μm2,and the mass amount of TH positive cells with brown cytoplasmic granular could be observed under high power microscope.TH positive cells in the PD model control group ranged 40 012 μm2,and the number of TH positive cells decreased significantly.TH positive cells in the PD model intervention group ranged 60 952 μm2,and the number of TH positive cells under high power microscope was significantly increased than that in the PD model control group; ⑤The results of TH protein expression detected by Western Blotting were as follows: the comparison between the normal control group and the PD model group wasP<0.001,between the normal control group and the PD model intervention group wasP<0.001,and between the PD model control group and the PD model intervention group wasP<0.05.Conclusion Anti-Parkinson granule can weaken the lost of TH-positive neurons in PD mice substantia nigra and striatum to some degree.Anti-Parkinson granule can partly protect dopaminergic neurons in aspects of quantity,morphology and function,and may have a hope to improve PD treatment status and a wide application in clinic.

Parkinson’s disease 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine Mouse Model Anti-Parkinson granule TH-positive neuron

上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)為13ZR1437400)

201200 上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

R742.5

A

1007-0478(2017)01-0008-06

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.01.002