成骨不全環狀RNA生物信息學分析

馬翔 魯艷芹 王延宙 劉軍龍 蘇學利 張遙 左清利 任秀智 韓金祥*

1. 濟南大學-山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，山東 濟南 250022 2. 山東省醫藥生物技術研究中心，山東省醫學科學院，山東 濟南 250062 3. 山東省立醫院，山東 濟南 250021 4. 天津市武清區人民醫院，天津 301700

環狀RNA作為新型的非編碼RNA分子穩定性高，存在范圍廣泛，具有高表達性、組織特異性以及良好的物種保守性。CircRNAs具有重要的調控功能，能作為miRNAs海綿功能分子[1]。在斑馬魚實驗中，胚胎中超高表達CDR1as 可導致斑馬魚腦中腦體積減少，將人/鼠的CDR1as注射到斑馬魚中會出現與miR-7敲除相似的表型，CDR1as的表達水平與miR-7靶基因表達水平表現出一致性，表明CDR1as是miR-7的環狀抑制劑[2-3]。研究發現circRNAs與阿茲海默癥、動脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥等疾病的發生有關[4-8]。最新研究發現在一些癌癥(肺癌、胃癌)等疾病中對于篩選出差異性表達的circRNAs，通過結合臨床信息以及醫學統計學檢驗，認為所篩選出的circRNAs具有作為疾病診斷潛在標記物的可能性[9-11]。同時又有研究發現相比于其他組織血液中很多circRNAs分子表達穩定性更高[12]，circRNAs所發揮的生物學功能和作為疾病診斷標志物在臨床治療上的潛力是巨大的。

成骨不全(osteogenesisImperfecta，OI)是一種通過遺傳或者基因突變而產生的先天性骨骼發育障礙結蹄組織疾病[13-15]。通過對116種相關的miRNAs進行檢測發現 miR-21與miR-26a等11 種miRNAs在成骨不全血清中存在差異表達[16-18]。本文擬通過生物信息學預測，分析與成骨不全差異性表達miRNAs相互作用的circRNAs，同時探討circRNA-miRNA-靶基因之間的相互作用。

1 材料和方法

1.1 miRNAs-circRNAs相互作用的生物信息學預測與網絡分析

采用starbase軟件(http://starbase.sysu.edu.cn/)[19]分別對成骨不全血清中差異表達的miR-21、miR-26a、miR-29a、miR-29b、miR-30e、miR-34c、miR-133a、miR-145、miR-210、miR-489與miR-1297等 11 種miRNAs進行生物信息學預測。采用Cytoscape 3.2.1(www.cytoscape.org)對在成骨不全血清中差異表達的上述11 種miRNAs通過starbase預測的141種circRNAs進行網絡分析[20]。參數設置：其中將circRNAs用圓形表示，miRNAs用正方形表示，節點的大小(圓的大小)代表該分子在網絡中的度(所對應的miRNAs鄰居個數)，顏色隨節點大小(圓的大小)由淺綠到深紅漸變。

1.2 miRNAs靶基因的生物信息學預測與網絡分析

通過miRWalk軟件(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk)[21]對上述在成骨不全血清中差異表達的11 種miRNAs利用DIANA-mT、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICTAR4、PICTAR5、PITA、RNA22與TargetScan十個數據庫進行靶基因的生物信息學預測。對原始數據首先進五個數據庫以上記錄的相互作用靶基因分析。將得到的靶基因采用Cytoscape 3.2.1[19](www.cytoscape.org)進行網絡分析。對預測的靶基因通過DAVID軟件(www.david.ncifcrf.gov)進行pathway分析[22]。

2 結果

2.1 miRNAs-circRNAs相互作用的生物信息學預測與網絡分析

Starbase軟件對11種不同miRNAs所預測的靶circRNAs的總數量為222個，其中非重疊circRNAs為141個。

對預測出的circRNAs進一步分析得出CPNE1_hsa_circ_000657與miR-26a、miR-34c、miR-30e和miR-1297等4種miRNAs相互作用；KIAA1586_hsa_circ_001439 與miR-29、amiR-29b、miR-34c和miR-133a等4種miRNAs相互作用；CYP4F3_hsa_circ_001395與miR-29a、miR-29b、miR-30e和miR-133a等4種miRNA相互作用；MIB1_hsa_circ_002013和MIB1_hsa_circ_000886與miR-29a、miR-29b、miR-34c和miR-145等4種miRNA相互作用。見圖1。14種circRNAs分別與3種不同的miRNAs共同相互作用。見表1、圖1。

2.2 miRNAs靶基因的生物信息學預測與網絡分析

MiRwalk對11種miRNAs靶基因預測結果中，對超過7個數據庫以上的三種情況進行分析。分析得到超過7個數據庫記錄的靶基因總數為1297個，非重疊靶基因944個。超過8個數據庫記錄的靶基因總數為416個，非重疊靶基因312個。超過9個數據庫記錄的靶基因總數為91個，非重疊靶基因70個。

Cytoscape網絡分析結果表明7個以上數據庫記錄的MiRNA-Taget Gene相互作用中CNOT6節點最大，其次ABCE1，BCL11A，ELF2，EML5，NAV3，JARID2，KLF4，QKI這8個靶基因節點較大。8個以上數據庫記錄的MiRNA-Taget Gene相互作用中ELF2與 NAV3基因節點最大分別與4個miRNA相互作用，PTEN、TET1、KBTBD8、TRIB2、RLF、REV3L、SBF2、PAN3、RARB 9個靶基因節點較大分別與3種不同miRNA相互作用。9個以上數據庫記錄的MiRNA-Taget Gene相互作用中僅NAV3基因節點最大與3個不同miRNA相互作用，ADAMTS6、ANKRD13C、C5orf13、COL11A1等19個靶基因節點較大分別與2種miRNA相互作用。

目前為止有文獻紀錄與骨病相關的信號通主要包括WNT、OPG/RNAKL/RNAK、TGF-beta、MAPK、NOTCH信號通路等途徑[23-24]。將超過7個數據庫與9個數據庫預測所共有的信號通路為Focal adhesion、ECM-receptor interaction、TGF-beta signaling pathway、Notch signaling pathway、Tight junction、Axon guidance、Pathways in cancer、Wnt signaling pathway、Small cell lung cancer、mTOR signaling pathway。見表1。

表1 成骨不全差異性miRNAs靶基因的KEGG信號通路在7-9以上預測數據庫中的P值變化Table 1 P value in KEGG signaling pathways of involved genes predicted by more than 7-9 databases targeting differentially expressed miRNAs of OI

對以上除腫瘤相關信號通路外其余信號通路得到的靶基因進行circRNA-miRNA-Target Gene分析表明，YES1基因與miR-133a、miR-145以及FAT1_hsa_circ_000713與LMNB2_hsa_circ_001499之間存在相互作用。PPP2CA與miR-29a、miR-29b、miR-133a以及KIAA1586_hsa_circ_001439之間存在相互作用。NTN4和SRGAP1與miR-26a、miR-145以及RFC1_hsa_circ_001649之間存在相互作用。見圖2。

圖2 成骨不全差異性miRNAs及其相互作用的circRNAs與靶基因的網絡分析Fig.2 Network analysis of the interaction among differentially expressed miRNAs of OI and predicted circRNAs and genes

圖3 成骨不全差異性miRNAs與其靶基因間相互作用網絡分析圖Fig.3 Network analysis between differentially expressed miRNAs of OI and predicted target genes

3 討論

本文分析預測出的4種差異性表達成骨不全miRNA所共有的MIB1_hsa_circ_000886等5種circRNA以及3種差異性成骨不全miRNA所共有的19種circRNA在成骨不全中的生物學作用仍需進一步實驗探究。同時所預測得到的相關circRNAs能否作為成骨不全血清中差異表達的11種miRNA的海綿功能需進一步實驗探究。通過對成骨不全血清中差異表達的11種miRNAs進行circRNAs及其靶基因的預測得到在Tight junction信號通路中 YES1基因與miR-133a、miR-145以及FAT1_hsa_circ_000713與LMNB2_hsa_circ_001499之間存在相互作用，TGF-beta，WNT以及Tight junction信號通路中PPP2CA與miR-29a、miR-29b、miR-133a以及KIAA1586_hsa_circ_001439之間存在相互作用，Axon guidance 信號通路中NTN4和SRGAP1與miR-26a、miR-145以及RFC1_hsa_circ_001649之間存在相互作用，這些相互作用的circRNA-miRNA-靶基因是否在成骨不全疾病中發揮著海綿功能需進一步實驗探究。

YES1是一種致癌基因，與ATP結合，酶聯反應，蛋白連接，表皮生長因子受體連接，離子通道綁定，受體結合等有關[25-26]。PP2A是一種絲/蘇氨酸磷蛋白磷酸酶，是一種多功能性蛋白酶，與細胞分裂周期和信號傳導相關。PP2A的催化亞基PP2Ac包括兩種亞型PP2CA和PP2CB，其在胚胎發育和阿茲海默癥和腫瘤等疾病中發揮著重要作用[27-29]。NTN4是一種蛋白編碼基因，發揮著laminin-1連接和蛋白連接的功能[30-31]。SRGAP1同樣也是蛋白編碼基因，發揮著GTPase激活功能，連接RacGTPase以及蛋白連接功能[32]。

骨的形成是通過成骨細胞合成骨基質，分泌骨基質，礦化骨基質而來。而成骨細胞來源于多潛能的間充質干細胞，多潛能的間充質干細胞存在于脂肪和骨髓中，其在兩種不同組織間的分化機制與多種生長因子和胞外信號通路相關，包括Wnt信號通路，OPG/RANKL/RANK、TGF-beta、MAPK、NOTCH、BMP信號通路，hedgehogs信號通路等[33-37]。Wnt信號通路中相關分子在骨髓間充質干細胞分化為成熟成骨細胞，成骨細胞的增殖以及功能上發揮著重要的調節功能，這些信號通路中的相關分子與細胞內鈣離子水平，骨密度，骨量密切聯系[37]。緊密連接(Tight junction，TJ)在細胞旁途徑中發揮著重要作用，同時參與調解細胞通透性，該信號通路與很多生理，病理等發生密切相關[38]。軸突導向(Axon guidance)是神經系統發育過程的一個分支[39]。TGF-beta 信號通路在胚胎發生，成骨細胞的分化與增殖，和軟骨損傷后的修復中發揮著重要的作用，同時影響多種組織的修復再生[34]。

小腦變性相關蛋白1的天然環狀反義轉錄物(antisense to the cerebellar degeneration-related protein1 transcript， CDR1as)中含有70個左右miRNA-7的結合位點，并且與相應的miRNA所作用的靶基因在表達水平上表現出一致性，作為miRNA的環狀抑制劑發揮著miRNA海綿功能，Y染色體性別決定區(sex-determining region Y，SRY)中含有16個miR-138的結合位點，同樣發揮著miRNA海綿功能[2-3]。通過對成骨不全血清中差異表達的11種miRNAs進行circRNAs及其靶基因的預測分析得到上述結果，所預測得到的相關circRNA-miRNA-靶基因中相關circRNA是否作為miRNA海綿功能影響相應靶基因表達進而在成骨不全疾病的發生以及發展中發揮著重要作用仍需進一步的實驗研究。