丹參酮ⅡA對生長期大鼠骨密度及骨形態計量學影響的研究

楊芳芳 高玉海 葸慧榮 陳克明 馬慧萍

1.甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000 2.蘭州軍區總醫院藥劑科，甘肅 蘭州 730050 3.蘭州軍區總醫院骨科研究所，甘肅 蘭州 730050

隨著老齡化社會的到來，骨質疏松癥(osteoporosis，OP)的發生率逐年上升，對人類生活質量和身體健康帶來了嚴重的威脅。目前臨床治療OP的化學合成藥物具有一定療效，但都有較大的不良反應[1]。我國清代王清任所著《醫林改錯》指出，“血液瘀滯，經脈不暢，水谷精微得不到布散，不僅臟腑因濡養不足而衰弱，骨髓也因此不得充潤……”，提示我們從活血化瘀的角度也有可能防治OP。蔡輝等[2]認為活血化瘀中藥在治療骨質疏松癥上呈現出多靶點、多環節、多通路、效果明顯、毒副作用少等特點。因此探索活血中藥預防與治療骨質疏松癥無疑具有潛在價值。丹參酮ⅡA是活血化瘀中藥丹參中的主要有效成分之一，實驗研究表明丹參酮ⅡA能提高體外培養大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)增殖速率，對BMSCs向成骨細胞分化有明確的誘導作用[3]。本實驗研究了口服丹參酮ⅡA對生長期大鼠骨密度和骨質量的影響，以初步探討用活血化瘀藥物預防骨質疏松癥的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

丹參酮ⅡA(陜西寶雞辰光生物科技有限公司，批號：20150816)；淫羊藿苷(陜西寶雞辰光生物科技有限公司，批號：20150125)；10%水合氯醛(天津市光復精細化工研究所)；雙能X射線骨密度儀(Lunar Prodigy, GE 公司，美國)；骨形成指標降鈣素檢測試劑盒和骨吸收指標TRAP5b檢測試劑盒(Rat-MIDTM Osteocalcin EIA和Rat TRAPTMELISA，IDS公司，丹麥)；SP1600硬組織切片機(LEICA公司，德國)；正置熒光顯微鏡(BX51，Olympus，日本)；酶標儀(Epoch, BioTek公司，美國)。

1.2 實驗對象

1月齡Wistar雌性大鼠30只，體重(95±3)g，由甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供(合格證號：SCXK(甘)2011-0001)，大鼠飼養于 SPF 級實驗室，自由飲水(自來水)和進食。

1.3 研究方法

1.3.1分組和給藥：實驗大鼠隨機分3組，每組10只，分別為丹參酮ⅡA組、淫羊藿苷組(陽性對照)和正常對照組。丹參酮ⅡA用蒸餾水配成 1.1 mg/mL的混懸液，按每只大鼠 11 mg/(kg·d)給藥；淫羊藿苷配成2.5 mg/mL的混懸液，按每只大鼠 25 mg/(kg·d)給藥；正常對照組灌服相同體積蒸餾水。每兩周稱一次體重。

1.3.2骨密度的測定：一個月測1次全身骨密度，檢測前先腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，待檢測到用藥組與對照組間有顯著性差異后即處死所有實驗動物，剝離椎骨、雙側股骨和脛骨，并保存于10%多聚甲醛中，測定椎骨和左側股骨骨密度。

1.3.3骨形態計量分析：將右側脛骨從10%多聚甲醛中取出。依次進行脫水、包埋、切片，再用1200、1500、2000目的砂紙均勻打磨至半透明，用品紅-苦味酸進行染色。鏡下觀察骨組織形態結構，用IPP 6.0軟件分析骨小梁相關參數，并觀察骨組織形態結構。

1.3.4測定血清生化指標：大鼠麻醉后，腹腔動脈取血，以5 000 r/min轉速離心10 min，取血清置于-80 ℃冰箱保存；按 ELISA試劑盒說明書步驟測定血清中TRACP 5b和骨鈣素(osteocalcin，OC)含量，繪制標準曲線，測定405 nm和450 nm處吸光值，計算含量。

2 結果

2個月后，各組實驗大鼠的存活率都是90%。

2.1 大鼠體重變化情況

3組大鼠的體重在實驗期間始終無明顯差異，丹參酮ⅡA組在第9周的體重略有下降，但與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。說明丹參酮ⅡA灌胃對大鼠體重無明顯影響。

圖1 大鼠體重測定結果Fig.1 The results of body weight in rats

2.2 大鼠骨密度測定結果

3組大鼠在第1個月的全身骨密度檢查結果雖有差異，但并無統計學意義(圖2)。第2個月的檢查結果見圖2，可以看到，與對照組相比，丹參酮ⅡA組和淫羊藿苷組的全身骨密度顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，而丹參酮ⅡA和淫羊藿苷組之間差異沒有統計學意義。大鼠處死后的離體骨密度檢測結果見圖3，可見丹參酮ⅡA組離體股骨骨密度極顯著高于對照組(P<0.01)，離體椎骨骨密度顯著高于對照組(P<0.05)；丹參酮ⅡA組和淫羊藿苷組之間差異沒有統計學意義，說明丹參酮ⅡA能有效提高大鼠全身和離體骨密度。

圖4 大鼠脛骨近心干骺端骨組織形態學變化(40×，標尺=1 000 μm)。A：對照組；B：淫羊藿苷組；C：丹參酮ⅡA組Fig.4 Morphology of the proximal metaphysis of the tibia (40×, ruler=1 000 μm). A: Control group; B: Icariin group; C: Tanshinone II A group.

圖2 大鼠全身骨密度值測定結果注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。Fig.2 The results of the whole-body bone mineral density in ratsNote: Compared with the control group, *P<0.05，**P<0.01.

圖3 大鼠離體骨密度測定結果注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。Fig.3 The results of bone mineral density ex vivoNote: Compared with the control group, *P<0.05，**P<0.01.

2.3 骨形態計量學分析結果

由圖4可知，丹參酮ⅡA組和淫羊藿苷組脛骨骨組織的網狀結構較對照組致密，量化分析結果顯示(表1)，丹參酮ⅡA組和淫羊藿苷組的骨小梁數目、骨小梁寬度和骨小梁面積百分比顯著高于對照組(P<0.05)，而骨小梁分離度顯著低于對照組(P<0.05)。說明可以改善松質骨的微結構，提高骨質量，見表1。

2.4 血清骨代謝指標檢測結果

與對照組相比，給藥組均能顯著提高大鼠血清中OC的含量(P<0.05)，同時顯著降低血清中TRACP 5b的含量(P<0.05)。說明丹參酮ⅡA促進骨形成和抑制骨吸收的雙重活性來提高骨密度和改善骨的微結構，見表2。

表1 各組大鼠脛骨近心干骺端組織計量學靜態參數Table 1 Histomorphometric indices in the proximal tibia metaphysis of rats

注：與對照組相比，*P<0.05。

表2 各組大鼠血清骨鈣素和抗酒石酸酸性磷酸酶的測定結果Table 2 The results of serum OC and TRACP

注：與對照組相比，*P<0.05。

3 討論

現代醫學證明，骨的微循環和血流變功能失衡必然會導致骨細胞的能量代謝發生紊亂，造成骨骼的微結構發生血液瘀滯，久而久之，骨小梁數目減少、強度降低，從而造成微骨折[4]。關于活血化瘀中藥治療骨質疏松癥的研究頗多，并發現其具有重要作用[5]。藥理學研究也表明，丹參酮ⅡA具有抗氧化、抗凝血、擴張血管、改變血液粘滯性、加快血液循環、改善微循環、增加心肌供血、抗菌消炎、抗腫瘤等作用[6]。這些功效與活血化瘀治療骨質疏松癥的理論相符合?？梢娪没钛隼碚撝委煿琴|疏松癥是一種有效的方法。此外，莫朝倫等[7]研究發現丹參酮ⅡA在一定的作用時間內，對體外培養的成骨細胞(osteoblast，OB)具有促增殖分化的作用。葉茂等[8]也發現丹參酮ⅡA能促進成骨細胞增殖，其機制可能是通過抑制成骨細胞的凋亡。還有研究表明其對體外培養破骨細胞具有抑制作用[9-10]，并能抑制骨吸收及降低骨轉換率以延緩或阻斷絕經后快速骨丟失[11]，能防止去卵巢大鼠腰椎和脛骨松質骨的丟失[12]。此外，丹參酮可以防止以維甲酸誘導的大鼠骨質疏松模型的骨丟失，其機制可能與提高激素水平、抑制骨高轉換有關[13]。目前，尚未發現國內外關于丹參酮ⅡA提高動物峰值骨量的研究，因此，此研究為開發預防與治療骨質疏松癥中藥單體新藥奠定了基礎。

有大量研究表明口服淫羊藿苷可通過抑制骨吸收而促進骨形成，提高大鼠的峰值骨密度和骨質量[14-15]，金雀異黃酮是公認的治療骨質疏松癥療效的藥物[16]，而口服淫羊藿苷與金雀異黃酮的對比研究顯示[17]，淫羊藿苷提高骨密度的能力強于金雀異黃酮，而且對骨硬度的提高能力具有同樣的表現，此研究并將金雀異黃酮藥物濃度(10 mg/kg)通過分子量換算成同樣摩爾濃度的淫羊藿苷(即 25 mg/kg)。因此，將淫羊藿苷作為此研究的陽性對照，并將丹參酮ⅡA的口服劑量用其同樣的方法換算，即為11 mg/kg。

本實驗研究結果顯示，灌服丹參酮ⅡA兩個月后，大鼠全身骨密度和離體骨密度都顯著增加，同時脛骨近端骨小梁的數量和寬度顯著增加，骨小梁分離度卻顯著減小，表明骨小梁的致密程度明顯增加。血清骨代謝指標檢測結果表明，大鼠的骨形成指標增加而骨吸收指標下降，表明丹參酮ⅡA可能是通過提高骨形成和抑制骨吸收而影響骨代謝，最終導致骨密度增加，骨質量明顯提高。上述結果表明，丹參酮ⅡA可以通過提高峰值骨量而達到預防老年性或絕經后骨質疏松的效果，具有開發抗骨質疏松新藥或先導化合物的潛在價值。