超聲引導細針穿刺標本BRAF V600E及CyclinD1聯合檢測對于甲狀腺癌患者頸部淋巴結轉移的預測價值

戴維德,馬 娜,王川予,吳明曉,張 征,陳 嵐,何淑蓉,韓秀婕,郭發金*

(1北京醫院超聲科,北京 100730;2北京醫院病理科;*通訊作者:E-mail:guofajinbh@163.com)

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超聲引導細針穿刺標本BRAF V600E及CyclinD1聯合檢測對于甲狀腺癌患者頸部淋巴結轉移的預測價值

戴維德1,馬 娜1,王川予1,吳明曉1,張 征1,陳 嵐2,何淑蓉2,韓秀婕1,郭發金1*

(1北京醫院超聲科,北京 100730;2北京醫院病理科;*通訊作者:E-mail:guofajinbh@163.com)

目的 探討利用超聲引導細針抽吸標本進行BRAF V600E與CyclinD1聯合檢測對于甲狀腺癌患者頸部淋巴結轉移的預測價值。 方法 我院2015-08～2016-12收治的經超聲引導細針抽吸細胞學檢查確診的甲狀腺癌患者56例,所獲得標本檢測BRAF V600E和CyclinD1。對BRAF V600E和CyclinD1檢測結果與隨訪結果進行回顧性分析。 結果 本組病例穿刺取材成功率為100%。56例患者中,39例檢出BRAF V600E突變,突變檢出率為69.6%;40例CyclinD1陽性表達,陽性表達率為71.4%。在30例既檢測出BRAF V600E突變又發生CyclinD1陽性表達的病例中,手術病理發現頸部淋巴結轉移18例,發生率為60%。其余26例病例中,手術病理發現頸部淋巴結轉移5例,發生率為19.2%(5/26),既檢測出BRAF V600E突變又發生CyclinD1陽性表達的病例頸部淋巴結轉移發生率明顯高于其余病例。 結論 利用超聲引導細針抽吸標本進行BRAF V600E與CyclinD1聯合檢測對于甲狀腺癌患者頸部淋巴結轉移有一定的預測價值。

超聲引導; 細針抽吸; 甲狀腺癌; BRAF V600E; CyclinD1

ultrasound guidance; fine needle aspiration; thyroid carcinoma; BRAF V600E; CyclinD1

甲狀腺癌(thyroid carcinoma,TC)是最為常見的內分泌系統惡性腫瘤。其中乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)發生率尤為最高,占全部TC的80%-85%[1]。由于TC發病率的快速增長,對于TC的預防、診斷和治療成為當前腫瘤研究的一個重點。文獻報道其頸部中央區淋巴結轉移率為20%-60%[2],而超聲檢查作為目前頸部淋巴結病變的首選檢查方法,對于較深位置或較小的頸部轉移性淋巴結的檢出率并不高,不能作為指導頸部淋巴結清掃的預測指標。有研究報道BRAF V600E突變及CyclinD1陽性表達與PTC不良預后相關[3]。本研究旨在探討利用超聲引導細針抽吸標本進行BRAF V600E突變及CyclinD1聯合檢測與PTC患者頸部淋巴結轉移的相關性,為PTC手術的必要性及頸部淋巴結清掃的實施提供分子診斷依據。

1 對象和方法

1.1 對象

我院2015-08～2016-12收治的經超聲引導細針抽吸細胞學檢查(ultrasound-guided fine-needle aspiration biopsy,UG-FNAB)確診手術治療的TC患者56例,其中男16例,女40例;年齡23-67歲,平均年齡(46.5±3.2)歲。本組病例中甲狀腺結節直徑在0.3-1.5 cm。FNA實施指征:具有超聲可疑惡性征象(形態不規則、縱橫比大于1、邊界模糊不清、極低回聲、微鈣化、中央型血流)。在行甲狀腺穿刺前常規檢測凝血功能、血常規;醫生向患者或其家屬詳細交代超聲引導穿刺的方法、目的、注意事項及可能的并發癥,并簽署知情同意書。

1.2 方法1.2.1 設備器材 GE LOGIQ E8型彩色多普勒超聲成像系統,探頭頻率6-15 MHz。穿刺器材:日本八光CL型23G吸引活檢針及10 ml一次性注射器各2支。

1.2.2 超聲引導下穿刺取材 患者常取仰臥位或側臥位,充分顯露穿刺部位,先進行甲狀腺常規超聲檢查,選擇最佳穿刺點、測量進針深度并完成體表定位。穿刺部位常規消毒鋪巾,2%利多卡因局麻后,手持活檢針,在彩超引導下避開大血管、神經及氣管等重要組織和臟器,進針到達腫塊邊緣。拔出針芯并接10 ml注射器,穿刺入腫塊內后,提拉注射器針芯至2 ml刻度處,使注射器保持負壓狀態,反復旋轉抽吸3-5次后改變進針方向,使針頭在腫塊內呈扇形朝不同方向抽吸,當注射器乳頭內出現吸取物后,去負壓退針。第一針取材常規涂片2-3張,置入95%乙醇固定液中送病檢。穿刺部位無菌紗布覆蓋并以適當力量壓迫穿刺點10 min。第二針取材注入液基薄層細胞學檢測(TCT)小瓶中并送病檢。穿刺部位無菌紗布覆蓋并以適當力量壓迫10 min。觀察20 min無不良反應方可離開。1.2.3 BRAF V600E基因檢測 受阻突變系統(amplification refractory mutation system,ARMS)方法檢測BRAF V600E基因突變狀態:取甲狀腺穿刺涂片,HE染色后,刮取細胞置于Eppendorf管中(盡量多刮取,保證腫瘤細胞數量≥200個)。提取基因組DNA操作流程按DNA提取試劑盒(廈門艾德診斷有限公司)說明書操作。ARMS方法檢測BRAF V600E基因突變,采用BRAF突變檢測試劑盒(廈門艾德診斷有限公司),實時熒光定量PCR儀器為ABI 7500 Fast型(美國Applied Biosystems公司)。實驗操作和結果判斷按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 免疫組化 抗體選用CyclinD1。將細胞塊脫蠟和水化,胰酶抗原修復,阻斷內源性過氧化物酶。先加入CyclinD1抗體,再加入加酶標聚合物。隨后DAB顯色、復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠和蓋玻片封片。1.2.5 結果判讀 Cyclin D1的陽性表達定位于細胞核。陽性細胞著色特征為棕黃色或棕褐色細顆粒樣分布。評分標準采用半定量積分法,將染色強度分3級:無著色記1分,淺著色記2分,棕黃色或棕褐色記3分;陽性細胞百分數≤5%為0分,>5%-25%為1分,>25%-50%為2分,>50%-75%為3分,>75%為4分。上述兩項評分的乘積為最后得分:0-1分為陰性(-);2-3分為陽性(+,++);>4分為強陽性(+++)。(+) 及以上評為陽性表達。

1.2.6 最終診斷標準 以TC手術病理學檢查結果為最終明確診斷的標準。

1.3 統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件,行χ2檢驗。

2 結果

2.1 超聲引導細針抽吸標本BRAF V600E與CyclinD1檢測

超聲引導細針抽吸標本BRAF V600E與Cyclin D1檢測及其結果見圖1-3。本組病例穿刺取材成功率為100%。56例患者中,39例檢出BRAF V600E突變,突變檢出率為69.6%;40例CyclinD1陽性表達,陽性表達率為71.4%。

圖1 超聲引導甲狀腺結節穿刺Figure 1 Ultrasound-guided fine needle aspiration of thyroid node

樣本擴增曲線(藍色)未升起，BRAF基因未發生突變樣本擴增曲線(藍色)升起，BRAF基因突變圖2 BRAF基因擴增曲線Figure2 AmplificationcurveofBRAFgene

圖3 CyclinD1陽性表達(DAB染色,×200)Figure 3 Positive expression of CyclinD1 (DAB staining,×200)

2.2 BRAF V600E與CyclinD1聯合檢測與頸部淋巴結轉移的相關性

在30例既檢測出BRAF V600E突變又發生CyclinD1陽性表達的病例中,手術病理檢查發現頸部淋巴結轉移18例,發生率為60.0%(18/30)。其余26例病例中,手術病理發現頸部淋巴結轉移5例,發生率為19.2%(5/26)。

BRAF V600E突變及CyclinD1陽性表達的病例頸部淋巴結轉移發生率明顯高于其余病例(χ2=9.57,P<0.01)。

表1 BRAF V600E與CyclinD1聯合檢測TC患者頸部淋巴結轉移的結果 (例)

Table 1 Combined detection of BRAF V600E and CyclinD1 in TC patients with cervical lymph node metastasis (cases)

BRAFV600ECyclinD1頸部淋巴結轉移陽性陰性合計陽性181230陰性52126合計233356

3 討論

TC作為最常見的頭頸部惡性腫瘤,約占所有惡性腫瘤的1%,其中又以PTC所占比例最大。近30年來,我國的TC發病率由約10/100萬上升到(30-40)/100萬,美國則由約49/100萬上升到143/100萬,增長了300.0%[4]。TC已然嚴重威脅著人類健康。高分化的PTC,其腫瘤細胞生長緩慢,患者預后較好,10年生存率大于90%,但仍有5%-20%的患者出現復發及遠處轉移。而頸部中央區淋巴結轉移率更是高達20%-60%,而超聲檢查作為目前頸部淋巴結病變的首選檢查方法,對于較深位置或較小的頸部轉移性淋巴結的檢出率并不高,不能作為指導頸部淋巴結清掃的預測指標[5]。隨著分子診斷技術的不斷提高,對與TC相關的分子標志物的研究也越來越深入,這些標志物對于TC的診斷、預后、治療方案的選擇能發揮重要作用[6]。本研究在超聲引導下,行甲狀腺結節細針穿刺,對其穿刺標本進行BRAF V600E及CyclinDl檢測,研究其與PTC患者頸部淋巴結轉移的相關性,為PTC術中頸部淋巴結清掃實施的必要性提供分子診斷依據。

研究表明,基因突變是腫瘤發生的重要因素,RAS-RAF-MEK-ERK-MARK是誘發細胞核內反應的重要轉導通路之一。BRAF基因位于RAS下游,是啟動PTC腫瘤癌變的關鍵基因之一,參與腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡。BRAF蛋白的主要功能是傳遞細胞膜上的信號,野生型 BRAF平時處于靜止狀態,執行任務時轉為活化狀態。而BRAF基因突變致使BRAF蛋白持續激活,不需要依賴RAS信號即可使 MEK1/2和 ERK1/2激酶磷酸化,從而使細胞發生異常改變。BRAF V600E突變作為最常見的變異形式,約占所有BRAF突變的95%[7]。近期一項Meta分析結果顯示,BRAF突變與患者的復發、淋巴結轉移、甲狀腺外侵犯、腫瘤更高分期有關[8]。CyclinD1屬于細胞周期蛋白家族,是一種重要的細胞周期正性調控因子。它主要在細胞周期G1進入S期過程中發揮調節作用。正常生理狀態下,CyclinD1在細胞進入S期后會快速裂解。如未發生裂解而表現為過表達,細胞周期的正常發展過程隨之會受到影響;表現為細胞增殖加快,從Gl期快速進入S期,最終發生癌變。研究發現 CyclinD1的過表達與TC的發生、發展及不良預后密切相關,可作為鑒別甲狀腺結節良、惡性及評估TC侵襲、轉移能力的分子指標之一[9-11]。

本研究應用超聲引導細針抽吸所得標本,對BRAF V600E及CyclinD1進行聯合檢測,結果顯示:56例患者中,BRAF V600E突變檢出率為69.6%;CyclinD1陽性表達率為71.4%。在30例既檢測出BRAF V600E突變又發現CyclinD1陽性表達的病例中,手術病理發現頸部淋巴結轉移18例,發生率為60.0%。而其余26例病例頸部淋巴結轉移為5例,發生率僅為19.2%。BRAF V600E突變及CyclinD1陽性表達的病例頸部淋巴結轉移發生率明顯高于其余病例。表明BRAF V600E突變及CyclinD1陽性表達與PTC患者頸部淋巴結轉移的有一定程度的相關性,可作為評估PTC侵襲、轉移能力的分子指標。從而提示臨床醫生及患者術中中央區淋巴結清掃及術后嚴密隨訪的必要性[12]。

總之,利用超聲引導細針抽吸所得標本檢測BRAF V600E及CyclinD1簡便實用、安全可靠,患者依從性好,結果與PTC患者頸部淋巴結轉移發生率具有較高程度的相關性,是影響PTC患者頸部淋巴結轉移的重要危險因素,可以作為實施PTC頸部淋巴結清掃術的分子診斷依據之一,具有較高的臨床應用價值。

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ObjectiveTo investigate the predictive value of combined detection of BRAF V600E and CyclinD1 in specimens by ultrasound-guided fine-needle aspiration from metastatic cervical lymph nodes in patients with thyroid carcinoma.MethodsFifty-six patients with thyroid carcinoma diagnosed by ultrasound-guided fine-needle aspiration cytology admitted to our hospital from August 2015 to December 2016 were enrolled in this study.The obtained samples were used for combined detection of BRAF V600E and CyclinD1.The results and the follow-up data were retrospectively analyzed and compared.ResultsThe success rate of puncture was 100%(56/56).Among 56 cases,39 cases had BRAF V600E mutation,and the mutation detection rate was 69.6%.CyclinD1 positive expression was detected in 40 cases,and the positive expression rate was 71.4%(40/56).Among 30 cases of both the detection of BRAF V600E mutation and CyclinD1 positive expression,18 cases(60.0%) of cervical lymph node metastasis were found according to surgical pathology.Among the other 26 cases,cervical lymph node metastasis was found in 5 cases,and the incidence was 19.2%(5/26).The incidence of cervical lymph node metastasis with both BRAF V600E mutation and CyclinD1 positive expression was significantly higher than that of the other patients.ConclusionThe combined detection of BRAF V600E and CyclinD1 in specimen by ultrasound-guided fine-needle aspiration in patients with thyroid carcinoma can be useful in predicting the cervical lymph node metastasis.

北京醫院臨床新技術創新課題(20160001)

戴維德,男,1971-09生,博士,主任醫師,E-mail:dai.weide@126.com。

2017-02-27

R736.1

A

1007-6611(2017)06-0589-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.017

Predictive value of combined detection of BRAF V600E and CyclinD1 by ultrasound-guided fine needle aspiration for cervical lymph node metastasis in patients with thyroid carcinoma

DAI Weide1,MA Na1,WANG Chuanyu1,WU Mingxiao1,ZHANG Zheng1,CHEN Lan2,HE Shurong2,HAN Xiujie1,GUO Fajin1*(1DepartmentofUltrasound,BeijingHospital,Beijing100730,China;2DepartmentofPathology,BeijingHospital;*Correspondingauthor,E-mail:guofajinbh@163.com