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FAM83B的表達與食管鱗癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性

2017-08-01 00:53:46李泓漪程彩霞翟元芳崔鶴洋畢煬輝馬燕春楊健孔鵬洲
山西醫(yī)科大學學報 2017年6期

李泓漪,程彩霞,翟元芳,崔鶴洋,畢煬輝,馬燕春,楊健,孔鵬洲*

(1山西醫(yī)科大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心,太原 030001;2山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院病理科;3山西醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院;*通訊作者,E-mail:kongpzh@163.com)

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FAM83B的表達與食管鱗癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性

李泓漪1,程彩霞2,翟元芳3,崔鶴洋3,畢煬輝3,馬燕春1,楊健1,孔鵬洲1*

(1山西醫(yī)科大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心,太原 030001;2山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院病理科;3山西醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院;*通訊作者,E-mail:kongpzh@163.com)

目的 探討FAM83B蛋白表達與食管鱗癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。 方法 采用組織芯片和免疫組織化學法檢測不同惡性程度食管鱗癌組織中和70例患者食管鱗癌及對應(yīng)癌旁組織中FAM83B的表達;應(yīng)用SPSS軟件分析食管鱗癌組織中FAM83B的表達水平及其與臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)性。 結(jié)果 FAM83B主要表達在食管鱗癌細胞的胞質(zhì)中;FAM83B在食管鱗癌組織中的表達量約為其癌旁正常組織1.5倍。FAM83B表達與患者的年齡、腫瘤的浸潤深度相關(guān)(P<0.05);單因素生存分析顯示,當食管鱗癌患者年齡小于60歲或者患者TNM分期為Stage Ⅰ階段時,FAM83B的表達量均與患者的生存時間呈負相關(guān)(P<0.05)。 結(jié)論 FAM83B可能參與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和浸潤,FAM83B的表達水平可能成為食管鱗癌預(yù)后強有力的預(yù)測因子。

食管鱗癌; FAM83B; 組織芯片; 免疫組織化學; 預(yù)后

食管癌是全球第八大癌癥,其致死率世界排名第6位[1-3]。食管鱗癌主要發(fā)生在亞洲地區(qū),同時也是我國食管癌主要的病理學類型,占到80%以上[2-4]。由于早期缺乏特異癥狀導(dǎo)致診斷不易,就診時70%-80%的患者已經(jīng)進入臨床中晚期,5年總生存率在15%-25%之間[3],Ⅲ期患者3年生存率僅10%左右,Ⅳ期患者3年生存率在5%左右[5]。因此亟需對食管癌癌變機制、腫瘤標志物、治療靶點等進行深入研究。

本課題組前期通過全基因組學測序發(fā)現(xiàn)了大量與食管鱗癌相關(guān)的遺傳變異[6,7],以及一系列與病理特征和臨床特征相關(guān)的基因,可以作為潛在的腫瘤分子標志物,并可對患者的預(yù)后和治療反應(yīng)做預(yù)測[8,9],FAM83B基因即是其中發(fā)生遺傳變異的基因之一。

FAM83B基因被認為是一種能夠促進永生化人乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)化的原癌基因[10]。有研究表明,FAM83B在多種人類腫瘤中不僅表達水平顯著提高,并且表現(xiàn)出了原癌基因的作用[11,12]。來自CCLE (cancer cell line encyclopedia)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)也同樣表明FAM83B的表達水平在多種人類腫瘤組織中有顯著增高,且在食管癌組織中的增高最為明顯。然而,FAM83B的表達與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚無研究報道。本研究用免疫組化的方法對石蠟包埋組織樣本和組織芯片進行檢測,通過檢測正常食管組織、非典型增生、原位癌以及G1-G3級食管鱗癌中FAM83B的表達,分析FAM83B的表達與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系,探討FMA83B作為食管鱗癌的診斷和預(yù)后預(yù)測的分子標志物的價值。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

本研究所用的食管鱗癌組織芯片包括兩部分:一部分為商品化組織芯片,包含正常食管黏膜組織10例、非典型增生10例、原位癌13例以及根據(jù)腫瘤的惡性程度分為三級(G1-G3)的食管浸潤鱗癌39例(G1、G2、G3各13例),購自上海芯超生物科技有限公司。另一部分為實驗室自制的驗證病例組織芯片,驗證病例選取來自山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院和河南省腫瘤醫(yī)院的食管鱗癌術(shù)后腫瘤組織及其癌旁正常組織的石蠟標本作為研究對象,其中食管鱗癌組織70例,對應(yīng)癌旁組織70例(經(jīng)HE染色證實均無癌細胞),所有病例經(jīng)病理確診均為鱗癌,所有患者的腫瘤樣本至少有40%-50% 的腫瘤細胞的含量,依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會癌癥分期標準(第七版)進行分期。70例食管鱗癌患者均為男性,平均年齡為59歲(44-78歲)。所有病例術(shù)前均未進行放化療等治療。

1.2 倫理聲明

本研究經(jīng)由山西醫(yī)科大學倫理委員會(批準號2009029)和河南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(批準號2009xjs12)批準。所有獲得的樣本在治療前均依據(jù)當?shù)貍惱砦瘑T會的指導(dǎo)以書面知情同意書的形式告知所有參與者。

1.3 主要試劑

兔抗人FAM83B抗體(艾博抗上海貿(mào)易有限公司,Abcam上海辦事處),抗體封閉用正常山羊血清(北京索萊寶科技有限公司),辣根過氧化物酶標記的二抗(羊抗兔)(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司),DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.4 驗證病例組織芯片的制備

組織芯片蠟塊制備儀制備10×6孔的組織芯片受體蠟塊,各孔間距1 mm、內(nèi)徑2.2 mm。調(diào)取石蠟標本對應(yīng)HE染色玻片,選取病變典型部位并在供體石蠟標本上做好相應(yīng)標記,打孔套針穿取直徑為2.2 mm的蠟塊組織芯放入受體蠟塊孔內(nèi),每個受體蠟塊左上角留2個空白孔用于定位。對制成的芯片蠟塊常規(guī)4 μm厚連續(xù)切片,敷貼在3-氨丙基-3-甲氧基硅烷處理的載玻片上,70 ℃過夜。

1.5 蛋白印跡雜交試驗檢測新鮮組織中FAM83B的表達情況

將3對驗證病例的新鮮組織從-80 ℃低溫冰箱中取出放入無菌研磨器內(nèi),加入適量含有終濃度為1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液,冰上充分研磨,靜置1 h,于1.5 ml EP管中 4 ℃、14 000 r/min離心15 min,取上清置于另一1.5 ml EP管中,按比例加入上樣緩沖液,煮沸10 min。20 μg處理后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5 g/L脫脂奶封閉1 h,分別與適當稀釋后的一抗4 ℃過夜孵育,PBST 洗膜,然后與1 ∶4 000二抗室溫孵育1 h,PBST 洗膜后加入發(fā)光底物孵育1 min,暗室中用X線片曝光、顯影、定影。

1.6 免疫組織化學檢測組織芯片中FAM83B的表達量

以PBS作陰性對照。標本經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶,PBS漂洗3遍,檸檬酸鹽修復(fù)液高壓修復(fù),山羊血清37 ℃封閉20 min,滴加一抗(FAM83B抗體濃度1 ∶100)4 ℃過夜,PBS漂洗3次,加入HRP標記羊抗鼠/兔二抗,37 ℃孵育15 min,PBS漂洗3次,DAB顯色液顯色,蘇木素復(fù)染3 min,鹽酸乙醇分化,脫水后封片保存。

以上免疫組化方法同時適用于商品化組織芯片和驗證病例蠟塊組織芯片。

1.7 結(jié)果判斷標準

每張切片高倍鏡(×100)下隨機選取5個視野,通過Aperio Cytoplasma 2.0軟件進行分析FAM83B的表達水平(用H值表示),FAM83B的表達量越高,H值越大。

1.8 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行。FAM83B表達量的最終數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。采用配對t檢驗分析食管鱗癌和其癌旁正常組織之間的差異。對兩組以上數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。χ2檢驗用于分析FAM83B的表達與患者臨床病理因素之間的關(guān)系。生存分析采用Kaplan-Meier生存分析并進行Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FAM83B在不同分級食管鱗癌組織中的表達和定位

利用FAM83B多克隆抗體對商品化的食管鱗癌組織芯片進行免疫組化檢測,結(jié)果所示,無論從正常食管組織、非典型增生、原位癌還是G1到G3級食管鱗癌組織,FAM83B的陽性染色均主要出現(xiàn)在食管正常/鱗癌組織的細胞質(zhì)中(見圖1),說明FAM83B主要在細胞胞質(zhì)中表達。

A.正常食管組織B.非典型增生組織C.原位癌組織D.G1級食管鱗癌組織E.G2級食管鱗癌組織F.G3級食管鱗癌組織G.陰性對照圖1 FAM83B在不同分級食管鱗癌中的表達(免疫組化)Figure1 TheFAM83BexpressionindifferentgradesofESCCtissuesbyimmunochemistry

2.2 不同分級食管鱗癌組織中FMA83B表達差異

通過Aperio Cytoplasma 2.0軟件對FAM83B的免疫組化結(jié)果進行定量分析。與正常食管組織相比,非典型性增生、原位癌以及G1-G3級食管浸潤鱗癌組織中FAM83B的表達水平均有顯著性增高(P<0.01或P<0.05,見圖2)。在G1-G3三個級別的食管鱗癌組織之間,FAM83B的表達水平差異沒有統(tǒng)計學意義。

2.3 FAM83B在食管鱗癌及其癌旁正常組織中的表達

為了再次確認FAM83B的表達水平,對所收集的70例配對的石蠟包埋組織樣本進行了免疫組化檢測,并在其中選取了3對病例的新鮮組織,提取蛋白后進行蛋白印跡雜交試驗。結(jié)果顯示食管鱗癌組織中的FAM83B的表達水平顯著高于癌旁正常組織,且至少為癌旁正常組織1.5倍(見圖3,4)。

與正常組織比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 不同分級食管鱗癌組織中FAM83B的表達水平Figure 2 The expression levels of FAM83B in different grades of ESCC tissues

圖3 食管鱗癌和癌旁正常組織FAM83B的表達水平Figure 3 The FAM83B expression of ESCC and adjacent normal tissue

圖4 食管鱗癌和癌旁正常組織的FAM83B的表達水平Figure 4 The FAM83B expression levels of ESCC and adjacent normal tissue

2.4 食管鱗癌中FAM83B的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

FAM83B在不同年齡和腫瘤浸潤深度間的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),在腫瘤分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤位置中的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見表1)。

2.5 FAM83B的表達以及患者年齡對食管鱗癌患者預(yù)后的影響

70例食管鱗癌患者中有完整隨訪信息61例,中位生存期為27(2-71)個月。61例食管鱗癌患者按年齡以60歲為臨界值分為兩組,<60歲的共有30例,其中FAM83B低表達的17例,FAM83B高表達的13例;在<60歲的患者中,FAM83B表達量的高低對患者的生存率有顯著影響,Log-rank檢驗顯示FAM83B低表達組總體生存率大于FAM83B高表達組(χ2=7.016,P=0.008,見圖5A)?!?0歲的共有31例,其中FAM83B低表達的11例,FAM83B高表達的20例,FAM83B表達量的高低對于≥60歲的患者的生存率沒有影響(χ2=1.198,P=0.274,見圖5B)。

表1 食管鱗癌組織中FAM83B的表達量與食管鱗癌患者臨床特征的關(guān)系

Table 1 Association between the expression level of FAM83B in ESCC tissue and clinicopathological variables of ESCC patients

臨床指標n高表達(n=36)低表達(n=34)χ2P年齡57190017? <60歲3513(186)22(314) ≥60歲3523(329)12(171)分級31630206 G13823(329)15(214) G2209(129)11(157) G3124(14)8(114)TNM分級02170642 StageI3720(286)17(243) StageIII3316(228)17(242)浸潤深度11410 0010? T1 50(00)5(71) T21511(157)4(57) T34725(357)22(314) T4 30(00)3(43)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移00480826 無3820(2857)18(257) 有3216(229)16(229)位置28610244 下段3923(329)16(229) 中段2811(157)17(243) 上段 32(286)1(142)

A.年齡<60歲組FAM83B的表達對生存期的影響 B.年齡≥60歲組FAM83B的表達對生存期的影響圖5 FAM83B的表達量和患者年齡對食管鱗癌患者生存期的影響Figure5 EffectofexpressionlevelofFAM83BinESCCtissueandageofthepatientsontheOSofESCCpatients

2.6 FAM83B的表達及TNM分期對食管鱗癌患者預(yù)后的影響

隨訪的61例患者按TNM分期分為兩組,Stage Ⅰ和Stage Ⅲ。Stage Ⅰ組共有33例,其中FAM83B低表達的16例,FAM83B高表達的17例;Stage Ⅲ組共有28例,其中FAM83B低表達的16例,FAM83B高表達的12例;當TNM分期為Stage Ⅰ時,FAM83B的表達量的高低對患者的生存率有影響,FAM83B低表達組總體生存率大于FAM83B高表達組(χ2=2.602,P=0.011,見圖6A);而當TNM分期為Stage Ⅲ時,FAM83B表達量的高低對患者的生存率的影響無統(tǒng)計學差異(χ2=0.011,P=0.915,見圖6B)。

A.TNM分期StageⅠ患者FAM83B的表達對生存期的影響 B.TNM分期StageⅢ患者FAM83B的表達對生存期的影響圖6 FAM83B的表達量和TNM分期對食管鱗癌患者生存期的影響Figure6 EffectofexpressionlevelofFAM83BinESCCtissueandTNMstageontheOSofESCCpatients

3 討論

食管癌是世界第八大腫瘤,每年新增病例約456 000例[1-3]。食管鱗癌是食管癌中影響我國以及其他亞洲國家的主要病理類型。食管癌的發(fā)生受到多方面因素的影響,如區(qū)域因素引起的不同的生活習慣、遺傳因素和環(huán)境因素等,飲酒、過度吸煙以及蔬菜水果攝入量不足都會增加食管鱗癌的患病風險[13-17]。食管鱗癌的發(fā)展是一個復(fù)雜的過程,它是從一個正常的鱗狀上皮開始,發(fā)展為一個低級別的上皮內(nèi)瘤變,然后是一個高級別上皮內(nèi)瘤變,最終形成浸潤性癌。由于食管鱗癌早期沒有特異性癥狀且缺少相應(yīng)的診斷方法,大多數(shù)食管鱗癌患者發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于中晚期階段[18-22],并且大多數(shù)患者在治療后臨床效果不佳,5年內(nèi)的復(fù)發(fā)率高,死亡率高。文獻顯示,僅有15%-20% 的食管鱗癌患者在診斷后能夠生存5年以上[23,24]。因此探究食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的分子機制,鑒定食管鱗癌早期診斷、預(yù)后和藥物靶點的新型分子標志物,對提高食管鱗癌患者的生存率具有重要意義。

FAM83B基因是本課題組前期食管鱗癌基因組測序篩選得到的顯著差異基因之一。目前對其功能研究較少。乳腺癌里的研究表明FAM83B能夠激活PI3K/AKT[10]和EGFR/RAS/MAPK[11]信號通路促進永生化人乳腺上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化。有研究表明,FAM83B在乳腺癌、卵巢癌、肺癌等多種人類腫瘤中均表現(xiàn)出原癌基因的作用且表達水平顯著增高[11,12]。

據(jù)報道,FAM83B通過激活MAPK和mTOR信號通路來促進永生化人乳腺上皮細胞的轉(zhuǎn)化,同時FAM83B的表達能夠激活PI3K/AKT信號通路,而針對MAPK和Akt/mTOR信號通路的靶向治療目前已應(yīng)用于多種腫瘤的臨床試驗[10],因此,當應(yīng)用針對MAPK和Akt/mTOR信號通路的靶向治療時,FAM83B的表達水平可作為一個很重要的參考因素[25]。

本研究采用免疫組化的方法檢測了不同惡性程度食管鱗癌組織中以及食管鱗癌及對應(yīng)癌旁組織中FAM83B的表達情況,并應(yīng)用SPSS分析軟件對免疫組化的結(jié)果進行分析,來探討食管鱗癌組織中FAM83B的表達情況及其與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同惡性程度的食管鱗癌組織中,FAM83B主要表達在食管鱗癌細胞的胞質(zhì)中且在原位癌組織中表達水平最高,并且食管鱗癌組織中的表達量是其癌旁正常組織1.5倍。對免疫組化的檢測結(jié)果進行分析后,發(fā)現(xiàn)FAM83B表達與患者的年齡、腫瘤的浸潤深度相關(guān),并且當食管鱗癌患者年齡小于60歲或者患者TNM分期為Stage Ⅰ階段時,FAM83B的表達均與患者的生存時間呈負相關(guān)。

綜上所述,本研究表明FAM83B在食管鱗癌組織中的高表達與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展浸潤關(guān)系密切,可作為評估食管鱗癌臨床進展和預(yù)后的重要參考指標,FAM83B也有可能成為食管鱗癌靶向治療新的潛在靶點。但以上結(jié)果仍需要大樣本的臨床病例及功能學實驗進一步的驗證。

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Expression of FAM83B in esophageal squamous cell carcinoma and its association with clinicopathological characteristics and prognosis

LI Hongyi1,CHENG Caixia2,ZHAI Yuanfang3,CUI Heyang3,BI Yanghui3,MA Yanchun1,YANG Jian1,KONG Pengzhou1*

(1TranslationalMedicineResearchCenter,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2DepartmentofGeneralSurgery,FirstHospitalofShanxiMedicalUniversity;3CollegeofBasicMedicalSciences,ShanxiMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:kongpzh@163.com)

ObjectiveTo explore the expression of FAM83B in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) and its relationships with clinicopathological characteristics and prognosis.MethodsThe expression of FAM83B was detected in esophageal tissues with diffe-rent degrees of malignancy and 70 cases of ESCC and corresponding para-carcinoma tissues by tissue microarray and immunohistoche-mistry.The relationships between the expression of FAM83B and the clinicopathological variables of ESCC patients were analyzed by SPSS analysis software.ResultsFAM83B positive staining was primarily observed in the cytoplasm of the ESCC cells.FAM83B expression level of ESCC was 1.5-fold as much as that of the corresponding para-carcinoma tissues.The expression of FAM83B was statistically associated with the age of the patient and the depth of tumor invasion(P<0.05).Univariate factor survival analysis showed that the expression level of FAM83B was negatively correlated with the survival time when the ESCC patients were less than 60 years old or TNM stage Ⅰ (P<0.05).ConclusionFAM83B may be involved in the occurrence,development and invasion of ESCC,and the expression of FAM83B may be a powerful predictor for the prognosis of ESCC.

esophageal squamous cell carcinoma; FAM83B; tissue microarray; immunohistochemistry; prognosis

國家自然科學基金資助項目(81602175)

李泓漪,女,1987-01生,碩士,助教,E-mail:me_lhy@126.com

2017-02-15

R735.1

A

1007-6611(2017)06-0583-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.016

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