HIV-1轉基因大鼠的腎臟氧化應激與凋亡基因的表達

高繼萍,皇甫冰,李莉紅,宋國華

(山西醫科大學實驗動物中心,太原 030001;*通訊作者,E-mail: ghsongg@hotmail.com)

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HIV-1轉基因大鼠的腎臟氧化應激與凋亡基因的表達

高繼萍,皇甫冰,李莉紅,宋國華*

(山西醫科大學實驗動物中心,太原 030001;*通訊作者,E-mail: ghsongg@hotmail.com)

目的 檢測HIV-1轉基因大鼠和F344大鼠腎臟COX3、COX5a、SOD2、GPx4、Caspase-1、Bax、BCL2L1、FasLg基因表達水平,探討相關基因表達與HIV-1致腎臟病理變化的相關性。 方法 以GAPDH為內參照,應用SYBR Green染料法進行相對實時熒光定量PCR檢測COX3、COX5a、SOD2、GPx4、Caspase-1、Bax、BCL2L1、FasLg在HIV-1轉基因大鼠和F344大鼠腎臟中的表達情況。 結果 HIV-1轉基因大鼠腎臟組織中氧化應激相關基因COX3、COX5a、SOD2、GPx4基因表達水平分別是F344大鼠的0.440，0.791，1.703，0.346倍,其中SOD2基因表達水平顯著升高(P<0.05),COX3、COX5a、GPx4顯著降低(P<0.05)。HIV-1轉基因大鼠腎臟組織中凋亡相關基因Caspase-1、BCL2L1、Bax、FasLg的基因表達水平分別是F344大鼠的1.389，1.145，0.400，0.590倍,其中,Caspase-1和BCL2L1基因表達水平顯著升高(P<0.05),Bax和FasLg顯著降低(P<0.05)。 結論 HIV-1通過下調抗氧化酶基因表達水平使腎臟發生氧化應激,通過調控凋亡基因表達水平來拮抗腎臟細胞凋亡。

HIV; 轉基因大鼠; 基因表達; 氧化應激; 細胞凋亡; 腎臟

自20世紀80年代證實人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)為艾滋病(AIDS)的病原體以來,由于HIV/AIDS有強烈的傳染性和高度的致死率,已成為一個嚴重的全球性公共衛生問題[1]。人體免疫缺陷病毒Ⅰ型通過病毒蛋白Tat或gp120作用于免疫系統中的巨噬細胞和T淋巴細胞等細胞,造成人類免疫缺陷病毒Ⅰ型感染,破壞人體免疫系統功能[2,3],伴隨著乙型肝炎(hepatitis B)[4]、心血管疾病(CVD)[5]、腎病等并發癥的發生,目前AIDS發病機制尚未充分闡明,所以開展HIV-1轉基因大鼠及探討HIV-1的損傷機制,對AIDS的早期診斷、治療及預后有重要意義。

機體在正常情況下會產生少量ROS,在自由基清除酶類和抗氧化劑的作用下能維持氧代謝平衡;一旦氧自由基產生過多或抗氧化體系出現故障,機體氧化與抗氧化系統之間的平衡被破壞,最終導致氧化應激。多項研究發現AIDS病人處于氧化應激狀態[6,7],HIV及其產物均可誘導腎臟產生細胞凋亡[8,9]。HIV-1轉基因大鼠作為研究AIDS比較好的動物模型有著明顯的優勢,為了更好地利用此模型,本實驗應用SYBR Green實時熒光定量PCR法檢測氧化應激相關基因(COX3、COX5a、SOD2、GPx4)及細胞凋亡相關基因(Caspase-1、Bax、BCL2L1、FasLg)在HIV-1轉基因大鼠和F344大鼠腎臟中的基因表達水平,分析相關基因表達與HIV-1致腎臟病理損傷的關系,并探討氧化應激和細胞凋亡在HIV-1損傷腎臟機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司,Revert Aid TM First strand cDNA Synthese Kit 購自美國Gibco BRL Life Technologies公司,SYBR Green熒光定量PCR試劑購自美國Bio-Rad公司。熒光定量PCR儀型號美國ABI公司7900HT Fast,分光光度計美國Thermo Fisher Scientific公司NanoDrop 2000c。

1.2 實驗動物及分組

SPF級成年雄性HIV-1轉基因大鼠和F344大鼠,8周齡,體質量250-300 g,購買于美國Harlan公司。按照弗吉尼亞大學的動物實驗操作規程于弗吉尼亞大學實驗動物中心進行飼養。適應性飼養1周,分別將HIV-1轉基因大鼠和F344大鼠作為實驗組和正常對照組,每組6只。本研究應用的HIV-1轉基因大鼠,是將F344大鼠9個HIV-1中的gag基因和po1基因進行敲除,使其失去病毒復制的能力,只表達剩余的7個基因。大鼠體內不包含病毒復制,病毒蛋白可以在多個器官內表達。

1.3 取材

將HIV-1轉基因大鼠和F344大鼠麻醉,處死,快速取出大鼠腎臟組織,將腎臟組織迅速放入液氮中速凍,然后轉移至-80 ℃冰箱保存,以備實時熒光定量PCR檢測。

1.4 引物設計

根據GenBank中公布的基因序列,應用美國ABI公司提供的Primer Express(v.3.0)軟件設計引物,引物由華大基因公司合成。所有引物序列見表1。將管家基因GAPDH作為內參照。

表1 qRT-PCR的引物序列

Table 1 The primer sequence of qRT-PCR

基因 上游引物(5′-3′)下游引物(5′-3′)Cox3ACGAGATATCATCCGTGAAGGAATTCCGTATCGGAGGCCTTTCox5aTGGGCCTTGACAAAGTGTAAACTTTCCAGGCAACTGTTTCAATCASod2CGCTGGCCAAGGGAGATCCCCGCCATTGAACTTCAGpx4ACGAGTTCCTGGGCTTGTGTTGCGAATTCGTGCATGGACaspase?1CCTCAAGTTTTGCCCTTTAGAAATTGAAAGTCTGTGCTGCAGATAATGBaxCTCAAGGCCCTGTGCACTAAACCCGGAGGAAGTCCAGTGTBCL2L1GCAGTCAGCCAGAACCCTATCTGTCCAAAACACCTGCTCACTCAFaslgCCAACCACAGCCTTAGAGTATCATCTGTTAAGTGGGCCACACTCCTTGAPDHATGGAAATCCCATCACCATCTTCGCCCCACTTGATTTTGG

1.5 總RNA的提取

按Trizol試劑盒說明書提取總RNA;NanoDrop 2000分光光度計檢測所提取樣品在波長260 nm和280 nm處的吸光度(A260和A280),計算RNA純度和濃度。總RNA-80 ℃保存備用。采用合格的RNA標本,按RevertAid TM First strand cDNA Synthese Kit說明書逆轉錄合成cDNA,-20 ℃保存。

1.6 實時定量PCR檢測腎臟組織中氧化應激和細胞凋亡相關基因表達水平

反應體系10μl:5μl 2×Power SYBR Green PCR Master Mix,2.5 μl上游和下游引物,2.5 μl cDNA模板。每個樣品均做3個復孔。反應條件:50 ℃ 1 min,95 ℃預變性10 min,95 ℃ 15 s,共40個循環;60 ℃延伸1 min。同時將定量模板梯度稀釋,每個循環結束時系統都會收集相應的熒光曲線的Ct值,反應全部結束后自動給出由定量標準模板建立的標準曲線。反應結束后用計算機將樣本與標準曲線對比得出各基因表達的拷貝數。

用內參基因GAPDH對目標基因進行均一化處理。由PCR反應曲線得到Ct值,采用ΔΔCt方法進行相對定量。校正公式為:Fold change=2-ΔCt,ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH。Ratio表示HIV-1轉基因大鼠腎臟組織中目的基因表達水平與F344大鼠中相對應基因表達水平的比值。

1.7 統計學分析

用軟件SPSS 22.0進行統計分析,采用t檢驗比較F344和HIV-1轉基因大鼠腎臟的相對基因表達差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各樣本的擴增曲線均已到達平臺期,樣品擴增的熔解曲線均未檢測到引物二聚體,無非特異性熒光信號干擾。

2.1 氧化應激相關基因實時PCR檢測結果

采用方差分析,結果顯示HIV-1轉基因大鼠腎臟中COX3、COX5a、SOD2、GPx4的基因表達水平與F344大鼠比較差異均具有統計學意義(P<0.05,見表2)。HIV-1轉基因大鼠腎臟SOD2基因表達水平顯著高于F344大鼠,其表達水平相對于GAPDH為F344大鼠的1.703倍 (見表2)。而COX3、COX5a、GPx4基因表達水平明顯下降(P<0.05,見表2)。

組別 nCOX3COX5aSOD2GPx4F344組61217±04211019±00831185±02281221±0356HIV?1組60536±00800806±00662019±02010423±0097t159220227412166P0001003500230003Ratio(HIV?1/F344)0440079117030346

2.2 細胞凋亡相關基因實時PCR檢測結果

方差分析結果顯示，HIV-1轉基因大鼠腎臟中Caspase-1、Bax、BCL2L1、FasLg的基因表達水平與F344大鼠比較均具有統計學差異(P<0.05,見表3)。與F344大鼠相比,HIV-1轉基因大鼠腎臟Caspase-1、BCL2L1基因表達水平明顯升高,分別為F344大鼠的1.389，1.145倍,而Bax、FasLg顯著降低,表達水平為F344大鼠的0.400和0.590倍(見表3)。

組別 nCaspase1BaxBCL2L1FasLgF344組61090±01931257±03691400±02801094±0230HIV?1組61514±02350502±01101463±00430645±0198t1394196102241479P0011000600440019Ratio(HIV?1/F344)1389040011450590

3 討論

氧化應激(oxidative stress)是引起許多疾病和機體損傷的分子病理基礎,是由于氧自由基(oxygen free radical,OFR)生成過多和/或細胞內自由基清除系統受損,導致OFR過量集聚,通過損傷生物大分子對細胞產生多種毒性作用。氧自由基的毒性作用在于對細胞生命活動中線粒體電子呼吸鏈及有關的酶的損傷[10]。細胞色素C氧化酶(COX)是線粒體呼吸鏈的重要組成部分。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶(GSH-R)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等構成酶類自由基清除系統。線粒體酶COX以及內源性抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性變化可反映體內OFR損害的程度。腎臟疾病是HIV感染的一個重要并發癥[11，12],HIV相關性腎疾病常為HIV感染病程晚期的嚴重并發癥,HIV感染腎臟并發癥的臨床和病理表現多樣,累及腎小球、小管、間質、血管等[13]。因此本實驗選取大鼠腎臟組織為研究對象。通過運用RT-PCR法檢測HIV-1轉基因大鼠和F344大鼠腎臟中氧化應激相關基因,結果顯示HIV-1轉基因大鼠腎臟同工酶COX3、COX5a基因表達水平對于F344大鼠明顯下降,具有統計學差異(P<0.05),提示HIV-1可能通過破壞線粒體功能,影響線粒體呼吸鏈中相關酶的活性,進而破壞氧代謝平衡,導致腎臟組織發生損傷。而HIV-1轉基因大鼠SOD2 基因表達水平顯著高于F344大鼠,而GPx4明顯低于F344大鼠,提示HIV-1轉基因大鼠酶類自由基清除系統合成障礙,抗氧化酶活性降低,或清除酶消耗過多,不能有效地清除過多的OFR,從而加速了艾滋的發生發展。研究表明,SOD可保護GPx和CAT免受O2的滅活作用,三種抗氧化酶之間形成一個完整的互助保護系統[14]。本實驗結果表明SOD2的代償性升高可以抵消過多的自由基,從而保護GPx4及腎臟細胞,但GPx4活性顯著下降及線粒體呼吸鏈的破壞,過量的OFR不能被有效地清除,不能中止自由基連鎖反應,促使腎臟發生過氧化損傷。

研究發現HIV基因產物對細胞凋亡具有雙重調節作用,既能促進細胞凋亡,也能抑制凋亡[15，16]。關于促進細胞凋亡主要取決于HIV基因編碼的產物,如胞膜糖蛋白復合體(gp120-gp41)與 CD4+T細胞相互作用激活Fas-FasL通路而觸發細胞凋亡[15]。Env與CD4+分子相互作用,不僅通過gp120與CD4+T細胞的交聯而激活FAS-FASL(CD95-CD95L)路徑引起細胞凋亡,還可以通過線粒體作用導致相應的多核巨細胞凋亡[16]。Vpr能夠引起完整細胞內線粒體跨膜電勢的快速衰退,釋放細胞色素C,觸發內源性凋亡途徑[15,17]。Tat通過下調BCL-2和上調caspase-8誘發凋亡[15，16]。HIV能在高水平的子代病毒產生之前抑制感染細胞的凋亡,現已發現,一些HIV基因產物具有抗凋亡活性[15],Nef gp120和Vpu都可下調感染細胞CD4受體的表達,從而阻止繼發的gp120-CD4介導的凋亡[18]。Nef下調感染細胞MHCⅠ類分子,從而有可能保護感染細胞免受CTLs或NK細胞的殺傷[19]。低水平表達的Vpr通過上調BCL-2和下調BAX抑制凋亡[20]。Tat通過降低TP53的轉錄而加速細胞循環過程抑制凋亡,使細胞增加病毒的產生[16]。Caspase-1不僅在炎癥反應中起重要作用,還與細胞凋亡過程有密不可分的關系。Caspase-1既可以引起細胞程序性死亡,也可以促進其生存。在某些類型的細胞中,Caspase-1偏向激活生存相關通路,而在另外一些細胞(如免疫細胞)中,死亡相關通路更易被激活[21]。本研究顯示:HIV-1轉基因大鼠腎臟中凋亡相關基因Caspase-1表達水平與F344大鼠相比顯著上調,差異具有統計學意義(P<0.05),HIV-1轉基因大鼠腎臟中促凋亡基因Bax含量較F344大鼠顯著降低,抗凋亡基因BCL2L1含量較F344大鼠顯著上升,均差異具有統計學意義(P<0.05)。由此推測,Caspase-1在HIV-1對轉基因大鼠腎臟細胞中執行抑制作用,促進細胞生存。本研究同時檢測凋亡相關基因FasLg表達發現,與F344大鼠相比,FasLg基因表達水平顯著下調(P<0.05),與以上推測結果相輔。因此,本實驗結果提示HIV-1通過調控凋亡基因表達來抑制腎臟細胞凋亡。

通過研究顯示,HIV-1通過破壞大鼠腎臟線粒體功能及抑制抗氧化酶的活性使機體處于氧化應激狀態,HIV-1對腎臟的損傷機制可能與氧化應激有關。HIV-1通過調控凋亡相關基因表達水平來抑制腎臟細胞凋亡的發生,推測HIV可能在腎細胞中操縱凋亡機制使其有利于自己的生存。但關于HIV-1抗腎臟細胞凋亡機制有待進一步探討。

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Gene expression of oxidative stress and cell apoptosis of kidney in HIV-1 Tg rats

GAO Jiping,HUANG Fubing,LI Lihong,SONG Guohua*

(LaboratoryAnimalCenter,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;*Correspondingauthor,E-mail:ghsongg@hotmail.com)

ObjectiveTo detect the mRNA expression of COX3,COX5a,SOD2,GPx4,Caspase-1,Bax,BCL2L1,FasLg in the kidney of HIV-1 Tg rats and F344 normal rats,and explore its relationship with renal pathology induced by HIV-1.MethodsSYBR Green based real-time fluorescence quantitative PCR with GAPDH as internal reference was performed for evaluating the expression of COX3,COX5a,SOD2,GPx4,Caspase-1,Bax,BCL2L1,FasLg genes in the kidney of F344 and HIV-1Tg rats.ResultsThe gene expression level of COX3,COX5a,SOD2,GPx4 in HIV-1 Tg rats respectively was 0.440,0.791,1.703,0.346 times of F344 normal rats.The gene expression levels of SOD2 were significantly higher in HIV-1 Tg rats than those of F344 normal rats,and the levels of COX3,COX5a,GPx4 were lower(P<0.05).The gene expression levels of Caspase-1,BCL2L1,Bax,FasLg in HIV-1 Tg rats respectively were 1.389,1.145,0.400,0.590 times of F344 normal rats.Compared with F344 rats,the gene expression levels of caspase-1 and BCL2L1 mRNA significantly increased,but Bax and FasLg significantly decreased in HIV-1 Tg rats(P<0.05).ConclusionHIV-1 can induce the oxidative stress by down-regulating gene expression levels of antioxidant enzyme and inhibit the renal cell apoptosis by regulating apoptosis-related gene expression levels.

HIV; transgenic rat; gene expression; oxidative stress; cell apoptosis; kidney

高繼萍,女,1987-07生,碩士,助理實驗師,E-mail:gaojiping951753@163.com

2016-12-29

R512.91

A

1007-6611(2017)06-0530-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.004