Hsa-miR-205-5p對食管鱗癌細胞系耐藥的影響

王 芳,肖帥帥,閻 婷*

(1山西醫(yī)科大學轉化醫(yī)學研究中心,太原 030001;2山西省腫瘤醫(yī)院普外科;*通訊作者,E-mail:enntei@hotmail.com)

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Hsa-miR-205-5p對食管鱗癌細胞系耐藥的影響

王 芳1,肖帥帥2,閻 婷1*

(1山西醫(yī)科大學轉化醫(yī)學研究中心,太原 030001;2山西省腫瘤醫(yī)院普外科;*通訊作者,E-mail:enntei@hotmail.com)

目的 研究hsa-miR-205-5p對食管鱗癌鉑類化療耐藥的影響。 方法 首先用RT-PCR法檢測hsa-miR-205-5p在食管鱗癌耐藥細胞系EcA109和敏感細胞系KYSE150中的表達。然后在EcA109和KYSE150中分別轉染hsa-miR-205-5p mimics,mimics NC和hsa-miR-205-5p inhibitor,inhibitor NC,用MTT和CCK8法檢測奧沙利鉑濃度為60,120,240,480,960 μmol/L對細胞增殖的影響。 結果 hsa-miR-205-5p在食管癌耐藥細胞系EcA109比在敏感細胞系KYSE150中低表達(P<0.05)。MTT和CCK8實驗結果表明,與轉染NC組相比,隨著奧沙利鉑濃度的增加,轉染hsa-miR-205-5p mimics組的EcA109細胞抑制率上升(P<0.05),轉染hsa-miR-205-5p inhibitor組的KYSE150細胞抑制率下降(P<0.05)。 結論 轉染hsa-miR-205-5p mimics后EcA109細胞對奧沙利鉑敏感性提高,轉染hsa-miR-205-5p inhibitor后KYSE150細胞對奧沙利鉑耐藥性增加。說明hsa-miR-205-5p過表達可抑制食管鱗癌細胞產(chǎn)生耐藥性。

hsa-miR-205-5p; mimics/inhibitor; 食管鱗癌; 耐藥

hsa-miR-205-5p; mimics/inhibitor; esophageal squamous cell carcinoma; chemo-resistance

食管癌是人類常見的消化道惡性腫瘤之一,世界上約一半的食管癌發(fā)生在我國,其病理類型以鱗癌為主,由于食管癌的發(fā)病原因及流行病學特點,使得我國成為世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家[1]。臨床數(shù)據(jù)顯示,盡管目前食管癌手術的R0切除率逐年增加,但是食管癌治療效果依然不盡如人意[2]。化療仍是食管癌主要的治療手段,但化療耐藥常常導致腫瘤治療失敗,成為食管癌治療的瓶頸。因此探尋食管癌化療耐藥機制,尋找與食管癌預后和治療療效相關的標志物,有效評估治療療效和預測預后成為近年來食管癌研究的熱點。

miRNA廣泛存在于真核生物中,長度約為21-24個核苷酸的單鏈、非編碼、內源性的小分子RNA。大量臨床實驗和研究表明,腫瘤耐藥細胞中存在miRNA表達異常,其異常會導致腫瘤細胞耐藥。因此miRNA作為預測化療療效和逆轉耐藥靶點成為近年來研究熱點。已有研究顯示,miRNA可通過調控上皮間質轉化、細胞凋亡基因表達、藥物外排作用相關蛋白表達、細胞損傷后自我修復能力相關基因表達等發(fā)揮耐藥機制。miR-205參與多種癌癥的調控。在喉鱗狀細胞癌中,miR-205調控癌細胞的侵襲和遷移。在非小細胞肺癌的早期檢測中,miR-21,miR-205,miR-155等可作為血清標志物[3,4]。但是關于miR-205參與腫瘤化療耐藥的報道甚少。

本實驗室對食管鱗癌細胞系進行小RNA測序系統(tǒng)分析,發(fā)現(xiàn)hsa-miR-205-5p在化療耐藥和敏感細胞系中表達差異顯著,推測其參與了食管鱗癌細胞耐藥機制的調控。本研究對hsa-miR-205-5p在食管鱗癌細胞耐藥中的作用進行了進一步驗證。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems),高壓滅菌鍋(日本Panasonic),CO2細胞培養(yǎng)箱(美國 Thermo),DMEM/F12培養(yǎng)基(美國HYCLONE),胰蛋白酶(美國HYCLONE),胎牛血清(美國GIBCO),逆轉錄試劑盒(德國QIAGEN),MTT(北京碧云天生物科技有限公司),DMSO(美國sigma),hsa-miR-205-5p inhibitor、hsa-miR-205-5p mimics、hsa-miR-205-5p mimics及inhibitor陰性對照(廣州銳博生物科技有限公司)。

1.2 奧沙利鉑化療藥物配制

奧沙利鉑(oxaliplatin)分子量397.29 g/mol,濃度范圍:0-1 200 μmol/L。母液配制:用生理鹽水溶解配成50 mg/10 ml(12.58 mmol/L),分裝300 μl/管,20 ℃密封儲存。釋液的配制:7 236.86 μl DMEM/F12完全培養(yǎng)基中加763.14 μl奧沙利鉑母液,配成1 200 μmol/L稀釋液8 ml,分別配制成60,120,240,480,960 μmol/L的稀釋液。

1.3 細胞轉染

轉染當天,取對數(shù)增長期的細胞進行實驗,將細胞接種于3個6孔板中,以(10-20)×105個細胞/孔的密度接種細胞,常規(guī)培養(yǎng)。將6孔板中的細胞分成6組,每組3個重復,分別轉染hsa-miR-205-5p-mimics(20 μmol/)0.6 μl、mimics NC 0.6 μl、hsa-miR-205-5p-inhibitor(20 μmol/L)6 μl、inhibitor NC 6 μl和無處理組,分別加入基礎培養(yǎng)基400 μl,吹打混勻后加入12 μl 轉染試劑,混勻后在超凈臺中靜置5-10 min。從培養(yǎng)箱中取出接種好細胞的6孔板,將不同的混合溶液分別滴入到6孔板每組細胞中,輕柔吹打混勻,5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉染36-48 h用胰酶消化細胞,進行后續(xù)實驗。

1.4 RT-PCR鑒定轉染效率

收集細胞沉淀,采用Trizol法提取總RNA。逆轉錄按照QIAGEN公司試劑盒說明進行,其反應體系為:5×miScript HiSpec Buffer 4 μl;10×miScript Nucleics Mix 2 μl;MiScript Reverse Transcriptase Mix 2 μl;RNA 500 ng-2 μg;RNase-free water補充至10 μl,37 ℃ 60 min;95 ℃ 5 min獲得cDNA。運用QIAGEN公司miScript SYBR?Green PCR Kit試劑盒進行實時熒光定量PCR驗證,內參基因為U6,其hsa-miR-205-5p上游引物為:5′-TCCTTCATTCCACCGGAGTCTG-3′,內參U6上游引物為:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′,下游引物為試劑盒自帶引物,按照如下反應體系:SYBR Mix 10 μl;hsa-miR-205-5p primer 2 μl;Reverse primer 2 μl;cDNA 1 μl;ddH2O 5 μl;總體積為20 μl。按照如下反應條件:95 ℃ 預變性15 min,94 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,70 ℃ 30 s,共40個循環(huán),72 ℃ 延伸10 min。

1.5 MTT法和CCK-8法檢測轉染前后對細胞增殖的影響

用胰酶消化對照組細胞、轉染hsa-miR-205-5p mimics或hsa-miR-205-5p inhibitor以及陰性對照和陽性對照組細胞,10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化,1 000 r/min離心3 min;棄去上清,加入10% FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞,以5 000個/孔密度接種于96孔板中,每組設置5個復孔。24 h,分別加入濃度為60,120,240,480,960 μmol/L的奧沙利鉑化療藥物。5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h,加入MTT溶液20 μl到96孔板中,5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清,加入DMSO溶液200 μl,將加入DMSO的96孔板放置在搖床上10 min以促進結晶充分溶解,觀察顆粒結晶逐漸溶解后,應用酶標儀檢測OD490 nm值。

CCK-8法:每孔加入CCK-8溶液10 μl,培養(yǎng)箱內孵育1-4 h,應用酶標儀檢測OD450 nm值。調零后,計算抑制率,抑制率=(實驗組-對照組)/(實驗組-0.05)×100%。

1.6 統(tǒng)計學分析

兩樣本間均值比較采用獨立樣本t檢驗;多樣本間的均值比較采用單因素ANOVA方差分析;統(tǒng)計軟件使用SPSS19.0。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 hsa-miR-205-5p在食管鱗癌耐藥和敏感細胞系中的表達

針對hsa-miR-205-5p設計PCR引物,real-time PCR檢測該miRNA在食管癌耐藥細胞系EcA109和敏感細胞系KYSE150中的表達情況。結果顯示hsa-miR-205-5p在EcA109中低表達,在KYSE150中高表達(P<0.05,見圖1)。

圖1 hsa-miR-205-5p在EcA109和KYSE150中的表達Figure 1 Expression of hsa-miR-205-5p in EcA109 and KYSE150 cell lines

2.2 轉染hsa-miR-205-5p mimics和inhibitor后細胞的表達

分別用hsa-miR-205-5p mimics和mimics NC轉染食管癌耐藥細胞EcA109,用hsa-miR-205-5p inhibitor和inhibitor NC轉染食管鱗癌敏感細胞KYSE150,用RT-PCR準確定量hsa-miR-205-5p的表達,以homo-U6作為內參,結果顯示:轉染hsa-miR-205-5p mimics組hsa-miR-205-5p表達量比轉染mimics NC組高15倍以上,轉染hsa-miR-205-5p inhibitor組hsa-miR-205-5p表達量和轉染inhibitor NC組相比差異顯著,經(jīng)統(tǒng)計學分析,均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖2)。

圖2 RT-PCR檢測hsa-miR-205-5p mimics/inhibitor轉染效率Figure 2 The transfection efficiency of hsa-miR-205-5p mimics/inhibitor by RT-PCR

2.3 轉染hsa-miR-205-5p mimics/inhibitor對奧沙利鉑敏感性的影響

各組細胞用不同濃度的奧沙利鉑作用48 h，MTT和CCK8法檢測細胞抑制率。結果顯示：在奧沙利鉑濃度為60，120，240 μmol/L時，轉染hsa-miR-205-5p mimics組的EcA109細胞抑制率與轉染mimics NC組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，當濃度為480，960 μmol/L時，兩組相比差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖3A和3C)，說明耐藥細胞系EcA109轉染hsa-miR-205-5p mimics后對奧沙利鉑濃度的敏感性提高。相反，在奧沙利鉑濃度為120，240 μmol/L時，轉染hsa-miR-205-5p inhibitor組的KYSE150細胞抑制率與轉染inhibitor NC組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，當濃度為60，480 μmol/L時，兩組的KYSE150細胞抑制率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖3B和3D)，說明敏感細胞系KYSE150轉染hsa-miR-205-5p inhibito后對奧沙利鉑的敏感性降低。綜上所述，改變細胞內hsa-miR-205-5p的表達，可使得細胞發(fā)生不同程度的耐藥性。

轉染hsa-miR-205-5p mimics或inhibitor與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01A,C.MTT法和CCK-8法分別檢測EcA109細胞轉染hsa-miR-205-5p mimics后對奧沙利鉑耐藥性的改變;B,D.MTT法和CCK-8法分別檢測KYSE150轉染hsa-miR-205-5p inhibitor后對奧沙利鉑敏感性的改變圖3 MTT法和CCK-8法檢測食管鱗癌細胞系對奧沙利鉑耐藥性變化Figure 3 The variation of oxaliplatin-resistant phenotype of ESCC cell lines by MTT and CCK8 assays

3 討論

現(xiàn)階段食管鱗癌的治療仍以采用手術為主,放療、化療、生物免疫治療以及分子靶向治療等為輔的綜合治療,但對于晚期不能手術的患者,化療仍是食管鱗癌的主要治療手段。近年來隨著化療藥物的研發(fā)以及一些分子靶向藥物的發(fā)展,比如mTOR抑制劑、Tarceva (EGFR受體的酪氨酸激酶抑制劑)、Avastin (VEGF抑制劑)、COX-2抑制劑等臨床應用,使食管鱗癌患者現(xiàn)狀得到明顯改善,但是隨之而來的耐藥性也逐漸顯現(xiàn)。因此,深入研究、挖掘與食管鱗癌耐藥相關機制迫在眉睫[5-8]。

近幾年對miRNA在腫瘤耐藥中的作用逐漸成為研究熱點,有文獻報道hsa-let-7c、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-423-5p等miRNA,分別通過上皮間質轉化、下調微管相關蛋白表達以及下調生長抑制因子4的表達、抑制ERBB2的表達等作用與化療耐藥密切相關[9-11]。TUBB3基因編碼的β-tububin-Ⅲ是抗微管藥物主要作用靶點,其高表達可導致抗微管藥物如紫杉類藥物發(fā)生耐藥,而miRNA-200c可以通過調控其靶基因TUBB3使其表達水平發(fā)生下調,改善卵巢癌細胞對不同化療藥物的敏感性[12]。miR-24結合位點上發(fā)生單堿基突變時,腫瘤細胞對甲氨蝶呤等化療藥物的敏感程度亦會發(fā)生顯著改變[13]。

目前,在食管鱗耐藥過程中miRNA譜的變化及其作用機制仍缺乏系統(tǒng)性研究。本課題組前期通過比較5-FU、奧沙利鉑、紫杉醇等化療藥物在各種食管鱗癌細胞系和正常食管細胞系的IC50,篩選出化療敏感細胞系和耐藥細胞系,進一步進行miRNA測序,鑒定出與耐藥相關的差異基因及miRNA,hsa-miR-205-5p就是表達差異的miRNA之一。miRNA-205-5p是高度保守的miRNA,主要表達在鱗狀上皮組織和乳腺組織[14-15]。有報道顯示,與正常組織相比,miRNA-205-5p在乳腺腫瘤組織中表達明顯下調,miRNA-205-5p可通過直接抑制ERBB2和間接抑制EGFR表達來抵抗靶向治療[16,17]。在前列腺癌中,miR-205通過調控EMT使其表達下調,提示miR-205可能參與調控耐藥表型,通過體內和體外研究發(fā)現(xiàn),miR-205介導自噬通路來影響前列腺間質細胞對順鉑的敏感性[18]。本研究表明,hsa-miR-205-5p在奧沙利鉑敏感細胞系中表達量明顯增高,且細胞學實驗表明 hsa-miR-205-5p過表達可抑制ESCC細胞產(chǎn)生耐藥性,相反則會促進ESCC的耐藥表型。推測hsa-miR-205-5p可能參與食管鱗癌化療耐藥的調控機制,但對其在食管鱗癌耐藥過程中發(fā)揮作用的具體機制尚需進一步研究。

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ObjectiveTo explore the effect of hsa-miR-205-5p on the drug-resistance of oxaliplatin to esophageal squamous cell carcinoma.MethodsRT-PCR was used to detect hsa-miR-205-5p expression in different drug-resistant phenotypes of esophageal carcinoma cell lines.EcA109 cell line and KYSE150 cell line were transfected with hsa-miR-205-5p mimics,mimics NC and hsa-miR-205-5p inhibitor,inhibitor NC,respectively.Then the cell proliferation was detected after treated with different concentration of oxaliplation using MTT and CCK8 methods.ResultsThe hsa-miR-205-5p expression was lower in EcA109 cell line than in KYSE150 cell line(P<0.05).Compared with NC group,the inhibition rate of EcA109 cell line rose in a dose-dependent manner after treated with oxaliplatin in hsa-miR-205-5p mimics group(P<0.05),and the inhibition rate of KYSE150 cell line decreased in a dose-dependent manner after treated with oxaliplatin in hsa-miR-205-5p inhibitor group(P<0.05).ConclusionSensitivity of EcA109 cell line on oxaliplatin is increased by transfection of hsa-miR-205-5p mimics,and the resistance of KYSE150 cell line to oxaliplatin is increased by transfection of hsa-miR-205-5p inhibitor,which suggests that the overexpression of hsa-miR-205-5p could inhibit the drug resistance of ESCC cells.

山西醫(yī)科大學博士啟動基金資助項目(03201557)

王芳,女,1988-08生,碩士,初級實驗師,E-mail:wangfang830@yeah.net

2017-02-27

R735.1

A

1007-6611(2017)06-0525-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.003

Role of Hsa-miR-205-5p in the chemo-resistance of esophageal squamous cell carcinoma

WANG Fang1,XIAO Shuaishuai2,YAN Ting1*(1TranslationalMedicineResearchCenter,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2DepartmentofGeneralSurgery,ShanxiCancerHospital;*Correspondingauthor,E-mail:enntei@hotmail.com