黃連素對(duì)Aβ誘導(dǎo)的大鼠抑郁行為的緩解作用及其相關(guān)機(jī)制

牛玉虎，郭國(guó)英，弓 韜，張 棟，王惠珍

(山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001；*通訊作者，E-mail：niuyuhu_8905@163.com)

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黃連素對(duì)Aβ誘導(dǎo)的大鼠抑郁行為的緩解作用及其相關(guān)機(jī)制

牛玉虎*，郭國(guó)英，弓 韜，張 棟，王惠珍

(山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001；*通訊作者，E-mail：niuyuhu_8905@163.com)

目的 探討黃連素側(cè)腦室注射對(duì)β淀粉樣蛋白引起大鼠的抑郁焦慮行為的緩解作用及其可能機(jī)制。 方法 60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、Aβ組、低劑量黃連素治療組、高劑量黃連素治療組和氟西汀陽(yáng)性對(duì)照組，每組12只，行為學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠抑郁焦慮行為，ELISA測(cè)定血漿皮質(zhì)醇和促腎上腺皮質(zhì)素含量。體外培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞分為對(duì)照組、Aβ組、低劑量黃連素組、高劑量黃連素組和氟西汀陽(yáng)性對(duì)照組，檢測(cè)各組細(xì)胞上清液腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，神經(jīng)生長(zhǎng)因子及膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的含量。 結(jié)果 懸尾實(shí)驗(yàn)與強(qiáng)制游泳實(shí)驗(yàn)顯示，Aβ組比對(duì)照組大鼠的活動(dòng)時(shí)間顯著減少(P<0.001)，高劑量黃連素治療組比Aβ組活動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，低劑量組與Aβ組差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)激狀況下Aβ組血漿皮質(zhì)醇與促腎上腺皮質(zhì)激素相較于對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，而正常情況下兩種激素在各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Aβ組相比，黃連素治療組兩種激素水平下降(P<0.01)。細(xì)胞上清液檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，Aβ組的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子及膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌水平明顯減低(P<0.001)，與Aβ組相比，高劑量黃連素治療組中三種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌水平均顯著增加(P<0.05)。 結(jié)論 黃連素能夠顯著緩解β淀粉樣蛋白引起的抑郁焦慮情緒，這種緩解作用可能與其對(duì)應(yīng)激性激素的調(diào)節(jié)以及對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌的促進(jìn)作用有關(guān)。

黃連素； β淀粉樣蛋白； 抑郁焦慮行為； 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子； 神經(jīng)生長(zhǎng)因子； 膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子； 阿爾茲海默病

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease,AD)，又稱老年性癡呆，是一種嚴(yán)重影響認(rèn)知以及其他神經(jīng)精神功能的神經(jīng)退行性疾病。2010年，中國(guó)AD確診病例接近570萬(wàn)人次[1]。隨著老齡化的發(fā)展，AD患病人數(shù)繼續(xù)逐年攀升，嚴(yán)重增加社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。AD患者主要表現(xiàn)為一系列與年齡相關(guān)的認(rèn)知功能障礙，例如空間學(xué)習(xí)能力以及認(rèn)知功能逐漸缺失等[2]。腦內(nèi)具有特異性淀粉樣蛋白聚集形成的老年斑是AD的重要病理特征[3]。而淀粉樣斑塊的形成與β淀粉樣蛋白(amyloid-beta,Aβ)的過(guò)度產(chǎn)生和異常聚集有直接的關(guān)系。在體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞，以及原代海馬神經(jīng)元的研究中早已證明Aβ能夠?qū)е聡?yán)重的神經(jīng)毒性作用[4]。這些神經(jīng)毒性作用包括神經(jīng)元電活性降低，神經(jīng)組織炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激，并且可最終導(dǎo)致神經(jīng)元的大量死亡形成腦萎縮[5-7]。而Aβ引起的神經(jīng)功能失調(diào)，不僅能夠引起動(dòng)物認(rèn)知功能的下降，也會(huì)嚴(yán)重影響大腦的情緒調(diào)節(jié)能力。據(jù)報(bào)道，Aβ可引起動(dòng)物抑郁情緒且可能是調(diào)節(jié)情緒行為的重要靶點(diǎn)[8]。與此同時(shí)，抑郁癥常規(guī)治療藥物氟西汀也表現(xiàn)出了對(duì)Aβ引起的神經(jīng)毒性的保護(hù)作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，AD伴隨的多種腦損傷，如海馬萎縮、突觸可塑性降低，、神經(jīng)遞質(zhì)水平以及突觸傳遞效能的減弱同時(shí)也是導(dǎo)致抑郁焦慮情緒的重要因素[10]。典型的AD動(dòng)物模型除認(rèn)知功能障礙外，同樣會(huì)表現(xiàn)出抑郁焦慮等多種神經(jīng)功能損傷的癥狀[11]。大量的臨床以及流行病學(xué)調(diào)查顯示，抑郁癥是AD的一大重要危險(xiǎn)因素，并且AD發(fā)病過(guò)程中往往伴有抑郁焦慮情緒的出現(xiàn)。有研究顯示針對(duì)抑郁情緒的治療可以改善AD病人的生活質(zhì)量[12-13]。所以，在尋求與發(fā)展新的AD治療藥物與治療靶點(diǎn)時(shí)，動(dòng)物的情緒調(diào)控能力是否改善應(yīng)該作為檢驗(yàn)藥物有效性的一個(gè)重要指標(biāo)。

從天然用藥成分中提取化學(xué)單體并開(kāi)發(fā)新藥是目前藥理學(xué)研究的重要策略之一。黃連素，又稱作小柴堿，是一種廣泛存在于各類中草藥如黃連中的芐基異喹啉類生物堿。黃連素可以抑制人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤H4細(xì)胞系中Aβ過(guò)度產(chǎn)生[14]。黃連素作為一種具有神經(jīng)保護(hù)功能的化學(xué)單體對(duì)Aβ引起的神經(jīng)毒性以及學(xué)習(xí)記憶損傷的阻止作用已經(jīng)在大量的報(bào)道中得以證實(shí)。在神經(jīng)退行性病變的疾病治療中的潛力也已有報(bào)道[15]。但是，黃連素在AD治療方面的有效性需要進(jìn)一步在動(dòng)物的情緒調(diào)控行為上繼續(xù)證實(shí)。除了對(duì)Aβ引起的神經(jīng)毒性具有拮抗效應(yīng)，AD癥狀條件下促進(jìn)神經(jīng)再生以及提高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持效應(yīng)對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)同樣至關(guān)重要。所以，本研究重點(diǎn)探索了黃連素對(duì)Aβ側(cè)腦室注射引起的抑郁以及焦慮樣行為的改善作用，并從神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)的角度探究了黃連素對(duì)應(yīng)激性相關(guān)激素分泌的影響，同時(shí)利用原代體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞檢測(cè)黃連素對(duì)促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的重要神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)是否具有恢復(fù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD (Sprague Dawley)大鼠60只，體質(zhì)量體質(zhì)量220-240 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物常規(guī)分籠飼養(yǎng)、自然晝夜節(jié)律、自由飲水進(jìn)食，室溫20-23 ℃，相對(duì)濕度40%-60%。

1.2 主要試劑與儀器

Aβ1-40(Sigma公司)；ELISA試劑盒(美國(guó)Enzo life science)；氟西汀(Sigma公司，美國(guó))；立體定位儀、顱骨鉆(瑞沃德生命科技有限公司，中國(guó))；OFT箱(瑞沃德生命科技有限公司，中國(guó))；高架十字迷宮(EPM迷宮)(瑞沃德生命科技有限公司，中國(guó))；酶標(biāo)儀(Bio-rad 680，美國(guó))。

1.3 動(dòng)物分組

60只雄性大鼠隨機(jī)分為5組(每組12只)，分別為對(duì)照組、Aβ組、黃連素低劑量組(5 mg/kg)、高劑量組(20 mg/kg)、以及氟西汀陽(yáng)性對(duì)照組。

1.4 AD模型建立與藥物治療

AD模型建立參照文獻(xiàn)[16]方法進(jìn)行。采用Aβ1-40(4 nmol/L，溶于生理鹽水)側(cè)腦室注射作為建立AD模型。大鼠經(jīng)水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 g/kg)，并將頭部固定于立體定位儀上，通過(guò)顱骨鉆鉆孔，用微量注射器注射Aβ1-40溶液(4 μl)，對(duì)照組注射相同體積的生理鹽水。側(cè)腦室定位為前囟點(diǎn)后0.8 mm，左側(cè)旁開(kāi)1.5 mm，深度3.6 mm。緩緩注入Aβ1-40溶液(15 min)并留針5 min，用骨蠟封口，封皮，將大鼠至于紅外燈下保持體溫并等待其蘇醒。黃連素與氟西汀溶液溶于生理鹽水中(10 mg/ml)，大鼠手術(shù)后第3天開(kāi)始連續(xù)灌胃1周[黃連素劑量5 mg/(kg·d)，20 mg/(kg·d)；氟西汀劑量：20 mg/(kg·d)]，期間監(jiān)測(cè)大鼠的體質(zhì)量。

1.5 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

主要包括以下內(nèi)容：強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾試驗(yàn)用于測(cè)定大鼠抑郁行為；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)則用于檢測(cè)大鼠焦慮樣癥狀。

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：將大鼠置于水深30 cm、直徑25 cm、高45 cm 的玻璃缸中，水溫23-25 ℃，并保證大鼠后肢不能觸及缸底，前肢不能附于缸壁頂部。實(shí)驗(yàn)時(shí)水缸周圍圍用黑色紙箱遮擋。實(shí)驗(yàn)觀察6 min，記錄后4 min內(nèi)大鼠累計(jì)靜止時(shí)間(大鼠停止掙扎或呈漂浮狀態(tài)，四肢有輕微動(dòng)作以保持頭部在水面)，期間攝像供實(shí)驗(yàn)后分析。游泳結(jié)束后用吹風(fēng)機(jī)將大鼠吹干。嚴(yán)格控制水溫，且每只大鼠實(shí)驗(yàn)前更換實(shí)驗(yàn)用水。

懸尾實(shí)驗(yàn)：強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日，將大鼠尾巴距尾尖部約1 cm處用膠布貼于懸尾箱(30 cm × 30 cm × 20 cm)支架上，使大鼠成倒掛狀態(tài)，其頭部離箱底約5 cm，一次懸掛1只大鼠。懸掛時(shí)間為6 min，統(tǒng)計(jì)大鼠整個(gè)過(guò)程內(nèi)懸尾累積不動(dòng)時(shí)間(不動(dòng)狀態(tài)即大鼠停止掙扎不動(dòng)或無(wú)任何活動(dòng))，實(shí)驗(yàn)期間攝像共實(shí)驗(yàn)后分析。

高架十字迷宮，宮體是由兩個(gè)開(kāi)放臂(長(zhǎng)50 cm，寬10 cm，高40 cm)以及兩個(gè)閉合臂(長(zhǎng)50 cm，寬10 cm，高40 cm)呈十字狀組成。開(kāi)放臂與閉合臂各呈直線排列。EPM試驗(yàn)中，將大鼠輕輕放置于宮體中央，保證其鼻端朝向開(kāi)放臂，并允許大鼠在宮體內(nèi)自由活動(dòng)5 min。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程有紅外攝像頭記錄，采集信號(hào)后對(duì)其運(yùn)動(dòng)軌跡利用軟件(Ethovision 3.0,Noldus Information Technology,荷蘭)進(jìn)行分析處理。通過(guò)記錄大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂以及閉合臂的次數(shù)和大鼠在開(kāi)放臂以及閉合臂分別停留的時(shí)間來(lái)評(píng)價(jià)其焦慮情緒。

運(yùn)動(dòng)模型建成后次日，不同組別大鼠進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test,OFT)。OFT箱大小為(100 cm×100 cm×40 cm)的無(wú)蓋方箱，箱體內(nèi)壁均為黑色。箱體底部被分為面積相等的25個(gè)正方型格子(20 m×20 m)，從左上角至右下角依次編號(hào)1-25，其中編號(hào)為7，8，9，12，13，14，17，18，19的方格范圍為中央?yún)^(qū)域，其余為外周區(qū)域。實(shí)驗(yàn)時(shí)輕抓大鼠尾部放入正中區(qū)即13號(hào)方格中后，采用紅外攝像監(jiān)測(cè)5 min內(nèi)大鼠在OFT箱的活動(dòng)軌跡，每只大鼠記錄完畢，清理曠場(chǎng)箱內(nèi)的排泄物，并用75%的酒精清洗箱體內(nèi)部，晾干后再進(jìn)行下只大鼠的測(cè)試。攝像采集信號(hào)由行為學(xué)分析軟件(Ethovision 3.0,Noldus Information Technology,Netherlands)進(jìn)行處理。以大鼠在OFT箱的總活動(dòng)距離、總穿越格數(shù)、中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí)間以及中央?yún)^(qū)域活動(dòng)距離，作為評(píng)價(jià)大鼠焦慮情緒的指標(biāo)。

1.6 大鼠外周血應(yīng)激激素測(cè)定

完成行為學(xué)檢測(cè)后的大鼠，尾靜脈收集靜脈血，并在取血后用大鼠束縛器(帶有呼吸孔的塑料圓筒)束縛大鼠30 min，造成短期應(yīng)激反應(yīng)，并立即從尾靜脈收集靜脈血，每次取血0.3-0.5 ml。所有收集血液3 000×g離心15 min收取血漿。ELISA試劑盒檢測(cè)血漿中皮質(zhì)醇以及促腎上腺皮質(zhì)激素：將樣品加入含有不同一抗(anti-CORT以及anti-ACTH)的96孔板中并室溫孵育2 h。孵育后洗凈96孔板，并加入帶有生物素的二抗(anti-rat-CORT antibody,anti-rat-ACTH antibody)37 ℃孵育90 min。加入1 mol/L的硫酸終止反應(yīng)，并立即在酶標(biāo)儀下測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度。每個(gè)樣本分別用3個(gè)復(fù)孔測(cè)定。

1.7 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

體外培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞分為對(duì)照組、Aβ組、低劑量黃連素組、高劑量黃連素組和氟西汀陽(yáng)性對(duì)照組。4周齡未經(jīng)處理的雄性大鼠通過(guò)水合氯醛麻醉處死并取腦并分離皮層組織。將分離的皮層剪碎后浸入無(wú)Ca2+和Mg2+的Hank’s溶液中。胰酶消化20 min，將皮層組織搗碎并用培養(yǎng)液清洗3次。培養(yǎng)液為DMEM加10%FBS，100 U/ml的青霉素以及100 μg/ml的鏈霉素。懸液1 200×g離心3 min，將細(xì)胞種在24孔板內(nèi)，密度2.0×105，培養(yǎng)在條件為37 ℃，5% CO2，并于種板后48 h 更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基更換頻率為每周2次。藥物(包括Aβ 1-40及不同濃度黃連素)溶于含有10%FBS的DMEM，同時(shí)含有100 U/ml的青霉素以及100 μg/ml的鏈霉素。Aβ 1-40(25 μmol/L)處理24 h后，治療組用不同濃度的黃連素處理(10-6,10-5mol/L)，同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照組用氟西汀溶液處理(10-5mol/L )。對(duì)照組加入不含有任何藥物的DMEM(10%FBS)。

1.8 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子檢測(cè)

ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，神經(jīng)生長(zhǎng)因子及膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。將樣品加入含有不同一抗(anti-BDNF，anti-NGF以及anti-GDNF)的96孔板中并室溫孵育2 h。移除樣品后與帶有生物素的二抗(anti-rat-BDNF antibody,anti-rat-NGF antibody,anti-rat-GDNF antibody)37 ℃孵育90 min。之后，加入1 mol/L的硫酸終止反應(yīng)，并立即在酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度。每個(gè)樣本分別用3個(gè)復(fù)孔測(cè)定。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃連素對(duì)Aβ引起的動(dòng)物焦慮抑郁行為的影響

強(qiáng)制游泳和懸尾試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比,Aβ組的運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著縮短(P<0.001，見(jiàn)圖1A、B)；與Aβ組相比，低劑量的黃連素組運(yùn)動(dòng)時(shí)間并沒(méi)有顯著變化，而高劑量黃連素組運(yùn)動(dòng)時(shí)間則顯著延長(zhǎng)(P<0.05，見(jiàn)圖1A、B)，同時(shí)，氟西汀陽(yáng)性對(duì)照組運(yùn)動(dòng)時(shí)間也顯著延長(zhǎng)(P<0.05，見(jiàn)圖1A、B)。說(shuō)明與Aβ組相比黃連素處理組緩解了Aβ誘導(dǎo)的抑郁樣行為學(xué)變化。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Aβ同樣導(dǎo)致了大鼠的焦慮樣行為，具體表現(xiàn)在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間的縮短(P<0.001，見(jiàn)圖1C)，以及高架十字迷宮中開(kāi)放臂中活動(dòng)時(shí)間的縮短(P<0.001，見(jiàn)圖1D)。高劑量黃連素緩解了Aβ導(dǎo)致的動(dòng)物焦慮行為的變化，具體表現(xiàn)在大鼠在高架十字迷宮開(kāi)放臂中活動(dòng)時(shí)間的增加(圖1D，P<0.05)。氟西汀陽(yáng)性對(duì)照組與Aβ組相比開(kāi)放臂活動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.05，見(jiàn)圖1D)。

1.對(duì)照組；2.Aβ組；3.黃連素5 mg/kg組；4.黃連素20 mg/kg組；5.氟西汀組與對(duì)照組比,***P<0.001；與Aβ組比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001 圖1 不同處理引起的動(dòng)物行為學(xué)變化Figure 1 Changes of animal behavior after different treatment

2.2 黃連素對(duì)大鼠體內(nèi)應(yīng)激激素的分泌影響

為了解黃連素能否引起大鼠應(yīng)激性激素升高的緩解作用，用ELISA法對(duì)不同條件下兩種應(yīng)激性激素血漿中皮質(zhì)醇以及促腎上腺皮質(zhì)激素的含量進(jìn)行了測(cè)定。在各組處理中，30 min的行動(dòng)束縛引起了兩種激素血液含量的顯著升高(F1,50=964.0,P<0.001，見(jiàn)圖2A;F1,50=441.3,P<0.001，圖2B)。在正常情況下，兩種激素水平在各組內(nèi)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖2)。行動(dòng)束縛后，Aβ組血漿中皮質(zhì)醇以及促腎上腺皮質(zhì)激素的血液含量顯著上升(P<0.01，見(jiàn)圖2)。低劑量以及高劑量黃連素組血漿中皮質(zhì)醇以及促腎上腺皮質(zhì)激素的上升均緩解(P<0.01，見(jiàn)圖2)，并且氟西汀也產(chǎn)生了相同效應(yīng)(P<0.01，見(jiàn)圖2)。

2.3 黃連素對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌的影響

檢測(cè)原代星型膠質(zhì)細(xì)胞上清液結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Aβ組腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子及膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量顯著下降(P<0.001，見(jiàn)圖3)。而高濃度的黃連素處理則顯著抑制了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量的降低(P<0.05，見(jiàn)圖3)。同時(shí)，氟西汀組與黃連素處理組具有相同效應(yīng)，膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌水平也升高(P<0.01，見(jiàn)圖3)。

A.黃連素抑制了壓力狀態(tài)下皮質(zhì)醇的過(guò)度分泌 B.黃連素抑制了壓力狀態(tài)下ACTH在血液的過(guò)量表達(dá)與對(duì)照組相比,**P<0.01; 與Aβ組相比,##P<0.01圖2 不同情況下與應(yīng)激狀態(tài)下各組皮質(zhì)醇與促腎上腺皮質(zhì)激素含量變化Figure 2 Changes of cortisol level and ACTH level after different treatment under normal or stress conditions

A.腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 B.神經(jīng)生長(zhǎng)因子 C.膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子1.對(duì)照組；2.Aβ組；3.10-6 mol/L黃連素組；4.10-5 mol/L黃連素組；5.氟西汀組與對(duì)照組相比,***P<0.001;與Aβ組相比,#P<0.05，##P<0.01 圖3 黃連素對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌的作用Figure 3 Effect of berberine on the production of neurotrophins from the glia cells

3 討論

作為一種神經(jīng)退行性疾病，AD病人伴隨著大量的神經(jīng)元死亡，神經(jīng)連接的丟失，神經(jīng)內(nèi)分泌以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的失調(diào)，同時(shí)可以導(dǎo)致除了認(rèn)知功能障礙的更多行為學(xué)表現(xiàn)。而其中，AD引發(fā)的抑郁樣癥狀便是一種伴隨著認(rèn)知功能同時(shí)產(chǎn)生的行為學(xué)障礙，并且這種相關(guān)的情緒失調(diào)也能夠?yàn)榛颊呒捌浼胰藥?lái)相當(dāng)顯著的精神和物質(zhì)壓力，并導(dǎo)致治療效果的下降。所以，在尋求治療AD的特效藥物時(shí)，針對(duì)其抑郁焦慮樣行為表現(xiàn)的特殊藥物的開(kāi)發(fā)也十分重要。同時(shí)，是否能夠產(chǎn)生情緒調(diào)控作用也應(yīng)該作為評(píng)價(jià)AD治療藥物的一個(gè)重要指標(biāo)。傳統(tǒng)中醫(yī)作為一種特殊的治療方式，一直尋求從天然藥物配伍出發(fā)，通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體功能達(dá)到治療目的。中藥配方中“君-臣-佐-使”的掌握也是對(duì)疾病治療的根本[17]。而從傳統(tǒng)中藥出發(fā)，從中藥方劑常用的天然植物中尋找生物活性成分已經(jīng)成為現(xiàn)代藥物開(kāi)發(fā)不可或缺的部分。黃連素的神經(jīng)保護(hù)作用已經(jīng)被廣泛證實(shí)。在中風(fēng)等嚴(yán)重影響神經(jīng)系統(tǒng)的疾病模型中，黃連素均顯示了顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，其重點(diǎn)表現(xiàn)在阻止神經(jīng)細(xì)胞的死亡以及對(duì)炎癥反應(yīng)的緩解等[18,19]。黃連素通過(guò)對(duì)β-分泌酶的作用從而抑制AD的發(fā)展已有相關(guān)報(bào)道[20]。然而，黃連素能否緩解AD導(dǎo)致的抑郁與焦慮作用的相關(guān)證據(jù)仍然欠缺。本研究從行為學(xué)角度首先證實(shí)了急性Aβ處理能夠引起動(dòng)物抑郁焦慮行為的變化，而這種變化同時(shí)能夠被黃連素以及典型的抗抑郁西藥氟西汀所緩解。這證明黃連素對(duì)動(dòng)物的情緒有調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步的神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃連素緩解了在壓力狀態(tài)下Aβ引起的應(yīng)激性激素的上升。應(yīng)激性激素皮質(zhì)醇和促腎上腺皮質(zhì)激素作為一種在壓力狀態(tài)下產(chǎn)生的激素，正常情況下能夠幫助動(dòng)物緩解適應(yīng)的復(fù)雜性。然而，在抑郁癥情況下，這些激素會(huì)長(zhǎng)期在體內(nèi)保留較高水平并且在相對(duì)輕度的壓力環(huán)境下加速釋放，通過(guò)影響下丘腦-垂體-腎上腺軸形成負(fù)反饋，進(jìn)一步導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺軸的持續(xù)亢進(jìn)。這也是抑郁癥的重要神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)機(jī)制之一[21]。持續(xù)性亢進(jìn)的下丘腦-垂體-腎上腺軸會(huì)導(dǎo)致海馬的一系列變化，并導(dǎo)致神經(jīng)功能的進(jìn)一步失調(diào)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Aβ同樣能夠?qū)е缕べ|(zhì)醇和促腎上腺皮質(zhì)激素的分泌增多，所以這有可能是AD中抑郁焦慮樣行為表現(xiàn)的重要原因之一。

Aβ作為AD中最重要的生物標(biāo)志之一，近年成為研究的熱點(diǎn)。Aβ能夠?qū)е聞?dòng)物學(xué)習(xí)記憶的減退，導(dǎo)致細(xì)胞毒性并引起神經(jīng)元的丟失，突觸可塑性的降低等病理變化，在AD發(fā)展過(guò)程中扮演了重要角色[22-24]。所以，以Aβ作為靶點(diǎn)清除其毒性作用成為了AD治療的一個(gè)關(guān)鍵思路。然而，僅僅對(duì)毒性蛋白這一單一因素進(jìn)行針對(duì)治療顯然不夠，藥物治療對(duì)AD這類多靶點(diǎn)神經(jīng)退行性疾病還需要能夠同時(shí)恢復(fù)神經(jīng)元的正常作用。而神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)于神經(jīng)元正常功能的發(fā)揮，如維持神經(jīng)元的完整性，突觸可塑性的幫助以及對(duì)神經(jīng)新生的幫助等均具有不可替代的意義[25，26]。本研究指出，Aβ干預(yù)后膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌減少，這可能是AD導(dǎo)致細(xì)胞損傷以及行為學(xué)異常的原因之一。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，黃連素處理和氟西汀效果相同，均緩解了Aβ引起的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的降低。所以，黃連素具有對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌和產(chǎn)生具有促進(jìn)作用。

本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究了黃連素對(duì)Aβ引起的抑郁焦慮情緒的治療作用以及其神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。陽(yáng)性對(duì)照氟西汀雖然具有相同的保護(hù)作用，但是這類藥物的副作用與高復(fù)發(fā)概率等均驅(qū)使科學(xué)家進(jìn)一步尋求更新的治療藥物。本研究通過(guò)研究AD中伴隨的抑郁焦慮情緒，探究了黃連素的神經(jīng)保護(hù)作用，為中醫(yī)藥天然植物提取成分對(duì)神經(jīng)退行性疾病治療的開(kāi)發(fā)和發(fā)展提供了指導(dǎo)意見(jiàn)，同時(shí)也為黃連素對(duì)AD引起的情緒失調(diào)的緩解作用提供了依據(jù)。

[1] Chan KY,Wang W,Wu JJ,etal.Epidemiology of Alzheimer's disease and other forms of dementia in China,1990-2010:a systematic review and analysis[J].Lancet,2013,381(9882):2016-2023.

[2] Jonsson T,Atwal JK,Steinberg S,etal.A mutation in APP protects against Alzheimer's disease and age-related cognitive decline[J].Nature,2012,488(7409):96-99.

[3] Lovell MA,Robertson JD,Teesdale WJ,etal.Copper,iron and zinc in Alzheimer’s disease senile plaques[J].J Neurol Sci,1998,158(1):47-52.

[4] Yankner BA,Dawes LR,Fisher S,etal.Neurotoxicity of a fragment of the amyloid precursor associated with Alzheimer’s disease[J].Science,1989,245(4916):417-420.

[5] Varghese K,Molnar P,Das M,etal.A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology[J].PLoS One,2010,5(1):e8643.

[6] Yan Q,Zhang J,Liu H,etal.Anti-inflammatory drug therapy alters beta-amyloid processing and deposition in an animal model of Alzheimer’s disease[J].J Neurosci,2003,23(20):7504-7509.

[7] Ferreiro E,Oliveira CR,Pereira CM.The release of calcium from the endoplasmic reticulum induced by amyloid-beta and prion peptides activates the mitochondrial apoptotic pathway[J].Neurobiol Dis,2008,30(3):331-342.

[8] Pomara N,Sidtis JJ.Brain neurotoxic amyloid-beta peptides:their potential role in the pathophysiology of depression and as molecular therapeutic targets[J].Br J Pharmacol,2010,161(4):768-770.

[9] Keowkase R,Aboukhatwa M,Luo Y.Fluoxetine protects against amyloid-beta toxicity,in part via daf-16 mediated cell signaling pathway,in Caenorhabditis elegans[J].Neuropharmacology,2010,59(4-5):358-365.

[10] Popoli M,Gennarelli M,Racagni G.Modulation of synaptic plasticity by stress and antidepressants[J].Bipolar disord,2002,4(3):166-182.

[11] Pugh PL,Richardson JC,Bate ST,etal.Non-cognitive behaviours in an APP/PS1 transgenic model of Alzheimer's disease[J].Behav Brain Res,2007,178(1):18-28.

[12] Wragg RE,Jeste DV.Overview of depression and psychosis in Alzheimer’s disease[J].Am JPsychiatry,1989,146(5):577-587.

[13] Clyburn LD,Stones MJ,Hadjistavropoulos T,etal.Predicting caregiver burden and depression in Alzheimer's disease[J].J Gerontol B Psychol Sci Soc Sci,2000,55(1):S2-S13.

[14] Asai M,Iwata N,Yoshikawa A,etal.Berberine alters the processing of Alzheimer’s amyloid precursor protein to decrease Abeta secretion[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,352(2):498-502.

[15] Ahmed T ,Gilani AU ,Abdollahi M ,etal.Berberine and neurodegeneration:A review of literature[J].Pharmacol Rep，2015，67(5):970-979.

[16] Wang XH,Yang W,Holscher C,etal.Val(8)-GLP-1 remodels synaptic activity and intracellular calcium homeostasis impaired by amyloid beta peptide in rats[J].J Neurosci Res,2013,91(4):568-577.

[17] Shi J,Tong Y,Shen JG,etal.Effectiveness and safety of herbal medicines in the treatment of irritable bowel syndrome:a systematic review[J].World J Gastroenterol,2008,14(3):454-462.

[18] Cui HS,Matsumoto K,Murakami Y,etal.Berberine exerts neuroprotective actions against in vitro ischemia-induced neuronal cell damage in organotypic hippocampal slice cultures:involvement of B-cell lymphoma 2 phosphorylation suppression[J].Biol Pharm Bull,2009,32(1):79-85.

[19] Zhang X,Zhang X,Wang C,etal.Neuroprotection of early and short-time applying berberine in the acute phase of cerebral ischemia:up-regulated pAkt,pGSK and pCREB,down-regulated NF-kappaB expression,ameliorated BBB permeability[J].Brain Res,2012,1459:61-70.

[20] Panahi N,Mahmoudian M,Mortazavi P,etal.Effects of berberine on beta-secretase activity in a rabbit model of Alzheimer’s di-sease[J].Arch Med Sci,2013,9(1):146-150.

[21] Pariante CM and Lightman SL.The HPA axis in major depression:classical theories and new developments[J].Trends Neurosci,2008,31(9):464-468.

[22] Roch JM,Masliah E,Roch-Levecq AC,etal.Increase of synaptic density and memory retention by a peptide representing the trophic domain of the amyloid beta/A4 protein precursor[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1994,91(16):7450-7454.

[23] Mark RJ,Hensley K,Butterfield DA,etal.Amyloid beta-peptide impairs ion-motive ATPase activities:evidence for a role in loss of neuronal Ca2+homeostasis and cell death[J].J Neurosci,1995,15(9):6239-6249.

[24] Selkoe DJ.Soluble oligomers of the amyloid beta-protein impair synaptic plasticity and behavior[J].Behav Brain Res,2008,192(1):106-113.

[25] Lo DC.Neurotrophic factors and synaptic plasticity[J].Neuron,1995,15(5):979-981.

[26] Schmidt HD，Duman RS.The role of neurotrophic factors in adult hippocampal neurogenesis,antidepressant treatments and animal models of depressive-like behavior[J].Behav Pharmacol,2007,18(5-6):391-418.

Effects of berberine on Aβ-induced depression and its possible mechanism

NIU Yuhu*,GUO Guoying,GONG Tao,ZHANG Dong,WANG Huizhen

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China；*Correspondingauthor，E-mail：niuyuhu_8905@163.com)

ObjectiveTo investigate the antidepressant and anti-anxiety effects of berberine in Aβ-induced depression rats and its possible mechanism.MethodsSixty rats were randomized into five groups (n=12 in each group):control group,Aβ group,low dose berberine group,high dose berberine group,and fluoxetine group.Behavioral tests were performed to determine the depressive and anxiety behaviors of rats in each group.Plasma levels of corticosterone and adrenocorticotropic hormone were detected by ELISA.Astrocytes were divided into five groups:control group,Aβ group,low dose berberine group,high dose berberine group and fluoxetine group.The concentrations of brain-derived neurotrophic factor(BDNF),nerve growth factor(NGF) and glia-derived neurotrophic factor(GDNF) in cell culture fluids were analyzed by ELISA.Results①The tail suspension and forced swim tests indicated that the mobility time significantly decreased in Aβ group compared with control group (P<0.001).While the mobility time was significantly prolonged in high dose berberine group compared with Aβ group(P<0.05).②ELISA assay for detecting the stress hormone in plasma showed that compared with control group,the production of cortisol and ACTH increased under the stress condition in Aβ group(P<0.001),but no significant difference was found among different groups under the normal condition.Additionally,compared with Aβ group,the secretion of two stress hormones decreased under the stress condition in berberine groups(P<0.01).③Compared with control group,the production of BDNF,NGF and GDNF decreased in Aβ group(P<0.001).Compared with Aβ group,the secretion of BDNF,NGF and GDNF significantly increased in high dose berberine group(P<0.05).ConclusionBerberine can alleviate the depressive and anxiety symptoms induced by Aβ.The improved regulation on stress hormone and promotion effects on production of neurotrophins might be the neurobiological mechanisms underlying these therapeutic effects.

berberine; amyloid-β; depressive-/anxiety-like behaviors; brain-derived neurotrophic factor; nerve growth factor; glia-derived neurotrophic factor; Alzheimer’s disease

牛玉虎，男，1985-05生，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，E-mail：niuyuhu_8905@163.com

2017-03-06

R749.1

A

1007-6611(2017)06-0519-07

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.002