綠原酸抑制HepG2細胞增殖的體外研究

閆 媛,李 杰,侯 妮,董 蕾

(1西安市中心醫院消化科,西安 710003;2西安交通大學第二附屬醫院普外科;3西安交通大學醫學院遺傳學與分子生物學研究室;4西安交通大學第二附屬醫院消化科;*通訊作者,E-mail:lijie.0532@hotmail.com)

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綠原酸抑制HepG2細胞增殖的體外研究

閆 媛1,李 杰2*,侯 妮3,董 蕾4

(1西安市中心醫院消化科,西安 710003;2西安交通大學第二附屬醫院普外科;3西安交通大學醫學院遺傳學與分子生物學研究室;4西安交通大學第二附屬醫院消化科;*通訊作者,E-mail:lijie.0532@hotmail.com)

目的 研究不同濃度綠原酸對肝癌細胞的抑制作用,以及對肝癌細胞MAPK/ERK信號通路的影響。 方法 分別應用50,125,250,500,1 000 μmol/L綠原酸與肝癌細胞株HepG2細胞共孵育24 h,Trypan blue染色并進行HepG2細胞計數,Western blotting測定HepG2細胞MAPK/ERK信號通路的ERK1/2磷酸化,CM-H2DCFDA熒光探針測定HepG2細胞內ROS濃度,觀察綠原酸對HepG2細胞增殖的抑制作用。 結果 與0 μmol/L組比較,500,1 000 μmol/L組HepG2細胞的增殖分別降低了45.5和81.7個百分點;綠原酸抑制HepG2細胞MAPK/ERK信號通路的ERK1/2磷酸化(P<0.01);綠原酸促進HepG2細胞內ROS濃度升高。 結論 綠原酸通過抑制MAPK/ERK信號通路的活化遏制肝癌細胞增殖。

綠原酸; MAPK/ERK信號通路; HepG2細胞

肝細胞肝癌是肝臟的惡性腫瘤,致死亡率高達93%[1,2],為全球第三位。原發性肝癌的主要致病因素是慢性乙型病毒性肝炎和慢性丙型病毒性肝炎[3],黃曲霉毒素、酒精和導致肝損傷的毒性化合物等也是肝癌的高危致病因子;近年來隨著非酒精性脂肪肝發病率的增高,其所引起的原發性肝癌發生比例也在同步增加。雖然肝癌的的診斷和治療在不斷地探索和研究過程中有一定的進展,但肝癌仍是一種高致死率的疾病。目前針對肝癌的治療方法主要為手術切除、肝移植、肝動脈灌注化療栓塞、分子靶向治療等。但是上述治療方法對患者生存期改善有限,治療后極易再出現病灶復發及轉移。如何抑制肝細胞癌變,降低慢性肝病進展為肝癌的發生率,越來越受到國內外學者的關注。

近年來,流行病學研究發現咖啡的消耗與肝癌的發病存在負相關,感染HBV患者的長期堅持飲用咖啡,可有效降低肝癌的發生率[4]。長期堅持飲用咖啡的HCV肝炎患者肝癌發生率較未飲用咖啡的慢性HCV肝炎患者的肝癌發生率顯著降低[5]。日本厚生勞動省一項調查顯示,喝咖啡組的肝癌發病率僅為不喝咖啡組的25%,喝咖啡可降低肝癌發病率[6]。綠原酸(chlorogenic acid,CGA)作為一種廣泛存在于自然界的多酚類化合物,主要來源于咖啡,具有廣泛的生物活性,具備抗氧化、抗炎癥作用、抗細菌、抗病毒及調節血脂等多種生物性作用。本研究應用人肝癌細胞株HepG2細胞,觀察綠原酸對肝癌細胞的抑制作用及作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要試劑

HepG2細胞購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection,ATCC),綠原酸購自美國Sigma-aldrich公司,CM-H2DCFDA熒光探針購自美國Invitrogen公司,ERK抗體、磷酸化ERK抗體、β-actin抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養及分組

使用10%胎牛血清、高糖DMEM培養基,置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養HepG2細胞,隔天換液,1 ∶4傳代,選擇中位線生長HepG2細胞進行實驗。消化制備單細胞懸液,進行細胞計數,以細胞濃度為2×105個/孔(每孔2 ml)接種于6孔板,設空白對照組及CGA干預組,其濃度分別為50,125,250,500,1 000 μmol/L,并設兩組復孔,37 ℃,5% CO2和飽和濕度條件下培養24 h。

1.3 Trypan blue染色計數HepG2細胞

棄培養基,PBS洗滌,胰酶消化收集細胞液,1 200 r/min離心5 min,棄去上清液,沉淀物加入200 μl PBS 輕柔吹打均勻成細胞液,取40 μl 細胞液加入20 μl 0.4% Trypan blue吹打均勻后于光學顯微鏡下計數未染色HepG2細胞(活性細胞)及藍色HepG2細胞(無活性細胞)。

1.4 CM-H2DCFDA熒光探針測定細胞內ROS

各組HepG2細胞800 μl PBS洗滌后,分別加入CM-H2DCFDA熒光探針(5 μmol/L),置入37 ℃,5%CO2培養箱5 min,PBS洗滌3次后于熒光顯微鏡觀察HepG2細胞內ROS濃度,以上操作在暗室進行。

1.5 Western blotting測定磷酸化ERK1/2表達

各組HepG2細胞加入細胞裂解液,收集裂解后HepG2細胞移入離心管,冰上1 h(每間隔10 min震蕩),4 ℃,14 000 r/min離心10 min,棄去沉淀,保留上清液。BCA法測定蛋白濃度,加入Loading buffer,Lysis,100 ℃煮沸5 min,分別制成20 mg/ml的蛋白樣品,經SDS-PAGE電泳及轉膜后,加入ERK(1 ∶1 000),磷酸化ERK(1 ∶1 000),β-actin(1 ∶2 000),4 ℃孵育過夜,用PBST充分洗膜后,加入二抗孵育液(1 ∶5 000)室溫孵育2 h,發光液浸膜5 min,化學發光法顯色,可見發光條帶,Quantity One(BIO-RAD)軟件進行圖像分析。

1.6 統計學分析

所有數據均采用SPSS18.0統計軟件進行分析處理,各組構成率比較應用Pearson χ2檢驗并進行相關性分析。計量資料以均數±標準差表示，采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CGA抑制肝癌細胞增殖

不同濃度CGA作用后,各組活性HepG2細胞與對照組總細胞對比,低濃度CGA 對活性HepG2細胞比例無影響,500 μmol/L CGA時活性HepG2細胞比例下降45.5個百分點(P<0.05),1 000 μmol/L CGA時活性HepG2細胞比例下降81.7個百分點(P<0.01，見圖1),當濃度>250 μmol/L時，CGA對HepG2細胞的抑制與濃度呈正相關。

與對照組(0 μmol/L)相比,*P<0.05,**P<0.01圖1 不同濃度CGA作用24 h HepG2細胞的存活率Figure 1 Viability of HepG2cells treated by different conccentration of CGA for 24 h

不同濃度CGA作用后,各組活性HepG2細胞與組內總細胞對比,各濃度組間無統計學差異(P>0.05,圖2)。

2.2 CGA抑制肝癌細胞MAPK/ERK信號通路的ERK磷酸化

50,125,250 μmol/L CGA對HepG2細胞的ERK磷酸化無明顯影響。500,1 000 μmol/L CGA 對HepG2細胞MAPK/ERK信號通路的ERK磷酸化呈現抑制作用,差異具有統計學意義(P<0.01,見圖3)。

圖2 不同濃度CGA作用24 h組內HepG2細胞的存活率Figure 2 Viability of HepG2cells intra-group treated by different conccentration of CGA for 24 h

2.3 CGA影響肝癌細胞內ROS濃度

隨CGA濃度增加,ROS稍增強,500 μmol/L、1 000 μmol/L CGA 時HepG2細胞內ROS顯著增加(見圖4)。

A.空白對照組;B.50 μmol/L CGA; C.125 μmol/L CGA; D.250 μmol/L CGA;E.500 μmol/L CGA;F.1 000 μmol/L CGA圖4 不同濃度CGA作用HepG2細胞內ROS熒光強度(×200)Figure 4 Fluorescence intensity of ROS in HepG2cells treated with different concentrations of CGA(×200)

3 討論

Ziech等[7]指出自然界存在的一些天然植物素對惡性腫瘤的發生有化學預防作用,本研究顯示綠原酸作為一種天然多酚類化合物,對HepG2細胞的增殖有抑制作用,其抑制作用與劑量呈相關性,低濃度綠原酸對HepG2細胞無明顯影響,但隨著濃度升高,綠原酸對HepG2細胞呈現抑制作用,500 μmol/L綠原酸使活性HepG2細胞減少45.5個百分點,1 000 μmol/L綠原酸使活性HepG2細胞減少81.7百分點(見圖1)。但綠原酸各濃度組間活性HepG2細胞差異無統計學意義(見圖2)。因此,綠原酸抑制HepG2細胞的增殖,并且綠原酸對HepG2細胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性。

ROS作為一種細胞內的重要信號分子,參與細胞內多條信號通路的傳導,涉及細胞的酶代謝、基因表達、炎癥反應等多種重要生理過程[8]。本研究通過應用CM-H2DCFDA熒光探針發現綠原酸影響HepG2細胞內的ROS濃度。國外研究發現ROS是MAPK/ERK信號通路的上游信號分子[9,10],細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK)調節轉錄因子活性,是傳遞絲裂原信號的信號轉導蛋白。ERK信號途徑在腫瘤侵襲和轉移過程調控基因表達,參與細胞生長、分化,并且在細胞惡變的演進過程起非常重要的作用。朱虹等[11]發現ERK在肝癌細胞表現為過度激活,趙雅娟等[12]發現ERK-1和Cyclin D1在肝癌中的表達顯著高于癌旁組織和正常組織。崔海鵬等[13]研究顯示肝癌發生過程中Ras激活MAPK/ERK和NF-κB通路促進Cyclin D1表達。有研究發現丙肝肝炎病毒E1蛋白可以促進肝癌細胞株SMMC-7721的MAPK/ERK信號通路活化從而促進肝癌細胞的增殖,ERK在肝癌的增殖過程起至關重要的作用[14,15]。因此,MAPK/ERK信號通路異常活化是肝癌發生發展的一個非常重要的發病機制。本研究通過Trypan blue染色觀察到綠原酸抑制肝癌細胞增殖,進一步實驗發現肝癌細胞內同步ROS濃度升高及ERK磷酸化抑制。由此可見綠原酸通過ROS的介導抑制肝癌細胞異常活化MAPK/ERK信號通路的ERK磷酸化進而來抑制肝癌的增殖。

綜上所述,本研究顯示綠原酸通過抑制肝癌細胞異常活化的MAPK/ERK信號通路活性來抑制肝癌細胞的增殖,進而遏制肝癌的生長,這為肝細胞肝癌的治療提供了新的治療靶點,因此,綠原酸作為一種天然酚類化合物可能被應用于治療肝癌。

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Vitro study of chlorogenic acid inhibiting proliferation of HepG2cells

YAN Yuan1,LI Jie2*,HOU Ni3,DONG Lei4

(1DepartmentofGastroenterology,Xi’anCentralHospital,Xi’an710003,China;2DepartmentofGeneralSurgery,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;3DepartmentofGeneticsandMolecularBiology,MedicineSchoolofXi’anJiaotongUniversity;4DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:lijie.0532@hotmail.com)

ObjectiveTo investigate the effect of chlorogenic acid(CGA) on hepatocarcinoma cells and MAPK/ERK pathway.MethodsHepG2cells were co-incubated with 50,125,250,500,1 000 μmol/L CGA for 24 h respectively.HepG2cells were counted after Trypan blue staining.ERK1/2 phosphorylation of MAPK/ERK pathway was detected by Western blotting.Intracellular concentration of reactive oxygen species(ROS) was detected using fluorescent probes after treatment with CGA.ResultsCompared with blank group,the proliferation of HepG2cells increased by 45.5 and 81.7 percentages in 500,1 000 μmol/L CGA group.The 500,1 000 μmol/L CGA inhibited ERK1/2 phosphorylation(P<0.01).Fluorescent probes results showed that CGA promoted ROS regeneration in HepG2cells.ConclusionCGA may inhibit the proliferation of hepatocarcinoma cells through preventing the activation of MAPK/ERK pathway.

chlorogenic acid; MAPK/ERK pathway; HepG2cells

閆媛,女,1973-09生,博士,副主任醫師,E-mail:yanyuancn@hotmail.com

2017-02-16

R735.7

A

1007-6611(2017)06-0515-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.001