加減駐景方對大鼠脈絡膜新生血管HIF-1α和Akt表達的影響

周志豪，亢澤峰，劉健，邢凱，陶方方，楮文麗

·論著：實驗研究·

加減駐景方對大鼠脈絡膜新生血管HIF-1α和Akt表達的影響

周志豪1，亢澤峰2，劉健2，邢凱1，陶方方2，楮文麗2

目的觀察中藥加減駐景方對脈絡膜新生血管（CNV）動物模型眼中缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）表達的影響，探討該組方對CNV的干預作用及其機制。方法將7周齡大雄性BN大鼠84只隨機分為4組，空白對照組（A組）12只，模型對照組（B組）24只，中藥治療組（C組）24只，西藥治療組（D組）24只。B、C、D組大鼠予氪激光右眼眼底光凝，A組常規飼養。造模后第21天時，C組予加減駐景方灌胃，10ml/(kg·d)，共21 d，B組予等量生理鹽水，D組予右眼眼內注射康柏西普眼用注射液，共1次。造模后第28、35、42天，各組動物行右眼底照相、熒光素眼底血管造影（FFA）檢查，同期制作眼后節石蠟切片，蘇木精-伊紅（HE）染色觀察激光斑處病理改變，免疫組織化學法檢測視網膜脈絡膜中HIF-1α和Akt的表達情況。結果1.FFA表現。A組各時間點未見異常熒光；B、C、D組模型眼激光斑晚期染色，造模后第28天時，三組模型眼光凝處均可見明顯的熒光滲漏，之后C、D組熒光滲漏逐漸減輕，D組減少更明顯，至造模后第42天時，C組僅有部分光斑出現熒光素滲漏，D組無明顯熒光素滲漏，B組熒光滲漏始終未見明顯變化。2.HE染色表現。各時間點，A組視網膜及脈絡膜結構完整連續，B、C、D三組均可見視網膜及脈絡膜結構破壞，內、外核層結構不連續。3.HIF-1α和Akt表達。A組各時間點視網膜脈絡膜中HIF-1α和Akt表達均為最低（P＜0.05），B組均為最高。C組造模后第35、42天時的HIF-1α和Akt表達低于B組（P＜0.05），但始終高于同期的D組（P＜0.05）。結論加減駐景方可降低CNV模型眼脈絡膜視網膜中HIF-1α和Akt的表達，從而抑制由氪激光光凝眼底而產生的CNV生長。

加減駐景方；脈絡膜新生血管；缺氧誘導因子-1α；蘇氨酸蛋白激酶；康柏西普眼用注射液

脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization, CNV）是異常的增殖血管，它來自脈絡膜毛細血管，突破脈絡膜毛細血管層的基底膜及Bruch膜進入視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）下，或視網膜神經上皮與RPE之間。由于其管壁具有較高的通透性，極易引起局部出血和滲出，繼而形成機化瘢痕組織[1]，造成視力嚴重下降，甚至致盲。CNV性眼底病變已成為國內外防盲治盲的重點，也是眼科領域研究的熱點和難點[2-4]。CNV的發生機制尚不完全明確，已知缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）相關信號轉導通路是產生CNV的重要途徑之一[5]，該信號通路能調控血管內皮生長因子（vascular en-dothelial growth factor,VEGF）的高度表達，而近年研究顯示絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）是調節HIF-1α表達的主要上游調控因子[6-7]。加減駐景方是在駐景丸的基礎上隨癥加減，并進行了大量臨床實踐觀察，經過反復推敲、驗證、優化、提煉形成的固定方劑；該方在臨床上已取得確切療效，能夠明顯促進出血、水腫吸收，改善患者視疲勞、視物變形、眼前遮擋感等，并能穩定病情，提高視力，減少復發。本研究通過氪激光誘導Brown Norway（BN）大鼠眼底CNV動物模型[8-10]，觀察了加減駐景方對HIF-1α和Akt表達的影響，具體報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：7周齡雄性BN大鼠84只，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。許可證號：SCXK（京）2012-0001。

實驗主要儀器和試劑：多波長氪激光機（Laserex LP352）、微量注射器（5μl）、TRC-50DX眼底照相機（北京拓普康醫療器械有限公司）、石蠟切片機、生物顯微鏡（重慶奧特光學儀器公司）；10%多聚甲醛、蘇木素染液、1%伊紅酒精溶液、兔抗人HIF-1α蛋白抗體、兔抗人Akt蛋白抗體、生物素標記的羊抗兔IgG、免疫組化試劑檢測盒、熒光素鈉注射液（美國Alcon Laboratories,Inc）。

實驗藥物：加減駐景方顆粒劑由四川新綠色藥業科技發展股份有限公司提供，其方主要由枸杞子、楮實子、菟絲子、五味子、茺蔚子、三七等組成，濃度為0.18 g/ml；康柏西普眼用注射液，由成都康弘生物科技有限公司提供（證書編號：CN20130483，產品批號：201606b15）。

1.2 方法

造模與分組：采用隨機數字表法將BN大鼠隨機分為空白對照組（A組）、模型對照組（B組）、中藥治療組（C組）及西藥治療組（D組），分別為12、24、24、24只。A組不做任何處理，B、C、D三組BN大鼠用濃度10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，復方托吡卡胺滴眼液（美多麗）點右眼散瞳，眼前放置蓋玻片，經裂隙燈用659 nm氪激光在視盤周圍、眼底血管之間光凝10~14個點，光斑直徑50μm，曝光時間0.05 s，功率360 mW。操作時聚焦于Bruch膜，當Bruch膜被擊破則有氣泡產生，視為有效點，若出血或無氣泡出現視為無效點。術后卡波姆眼用凝膠點眼。造模后第3天散瞳查眼底，剔除造模不成功者。造模后第21天，C組予前述加減駐景方配方顆粒混懸液灌胃，10 ml/(kg· d)，每日1次，連續給藥21 d；B組予等量生理鹽水灌胃，頻次及給藥時間同C組；D組同期予右眼玻璃體腔注射康柏西普5μl，共1次。操作人員固定。

熒光素眼底血管造影（FFA）觀察CNV滲漏情況：A組隨機選取3只，B、C、D三組隨機各選取6只BN大鼠，分別于造模后第28、35、42天時麻醉、散瞳，眼底彩色照相后給予尾靜脈注射熒光素鈉2 ml，行FFA檢查，動態觀察比較各組各時間點造影晚期的熒光滲漏程度。

取材及石蠟切片：B、C、D三組分別于造模后第28、35、42天各隨機選取6只BN大鼠，A組各時間點隨機選取3只，腹腔注射過量10%濃度的水合氯醛處死，取右眼，立即轉移至10%多聚甲醛液，固定24 h，去除眼前節，經梯度酒精脫水后，浸蠟，包埋，平行于視軸方向切片，厚度約為4 μm，切至激光斑處收片。

蘇木精-伊紅（HE）染色：A組選取視網膜及脈絡膜結構完整連續的石蠟切片，B、C、D三組各選取一至兩張有激光斑的石蠟切片，且視網膜及脈絡膜結構完整連續，蘇木素-伊紅染色，利用光學顯微鏡觀察激光斑處視網膜脈絡膜病理改變并拍照。

免疫組織化學檢測：將石蠟切片置于預先用3-氨丙基-3-乙氧基硅烷（APES）處理過的載玻片上，A組選取視網膜及脈絡膜結構完整連續的石蠟切片，B、C、D三組盡量選取有激光斑且視網膜脈絡膜連續的切片，60℃恒溫箱烤片過夜；二甲苯脫蠟至水，滴加3%H2O2，室溫10 min以滅活內源性酶，蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸泡5 min×2次，抗原修復，滴加小牛血清，室溫封閉30 min，甩去多余的液體，不洗。加入一抗[兔抗人HIF-1α、Akt蛋白抗體（1∶200）]37℃孵育1～2 h，PBS沖洗5 min×3次；加入二抗（生物素標記的羊抗兔IgG），37℃孵育30min，PBS沖洗5min×3次，滴加適量的辣根酶標記的鏈酶卵白素工作液；3-氨基-9-乙基卡唑（AEC）顯色，HIF-1α、Akt陽性表達為紅色或棕色，封片，拍照。利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測量HIF-1α、Akt表達的平均光密度值。

1.3 統計學方法

實驗數據采用SPSS 20.0系統軟件進行統計處理。計量資料以x軃±s表示，多組比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FFA表現

FFA顯示，造模后第28天時，B、C、D組眼底光凝處在造影晚期均表現為強熒光，并有熒光滲漏。造模后第35天，三組光凝處仍可見熒光滲漏，B組滲漏面積大于C組，D組為少量熒光滲漏；造模后第42天，B組造影晚期可見較為廣泛的熒光滲漏，C組僅有部分光斑出現熒光滲漏，D組無明顯熒光滲漏。A組眼底上述各時間點均未見熒光滲漏（圖1，圖2）。

圖1 BN大鼠右眼彩色眼底像。1A.空白對照組，1B.模型對照組激光造模后第42天圖2各組BN大鼠右眼FFA像。2A.空白對照組，無熒光滲漏；2B.模型對照組造模后第42天，晚期有明顯的熒光滲漏（白箭）；2C.中藥治療組造模后第42天，晚期也出現熒光滲漏，相對較少（白箭）；2D.西藥治療組右眼造模后第42天，晚期熒光著染（白箭）FFA：熒光素眼底血管造影

2.2 HE染色結果

光學顯微鏡下觀察，A組BN大鼠視網膜、色素上皮層、脈絡膜結構清晰完整。B、C、D三組BN大鼠右眼經氪激光誘導后，激光斑處可見RPE層和Bruch膜結構明顯破壞，內核層和外核層結構紊亂，并可見異常的增生細胞突破脈絡膜毛細血管層的基底膜，通過Bruch膜繼而移行并穿透RPE層，生長于視網膜神經上皮下（圖3）。

表1 各組大鼠不同時間視網膜脈絡膜中HIF-1α表達的平均光密度值（±s）

表1 各組大鼠不同時間視網膜脈絡膜中HIF-1α表達的平均光密度值（±s）

注：同一時間多組間比較采用單因素方差分析，各組兩兩比較采用LSD法。①與A組比較，P＜0.05；②與B組比較，P＜0.05；③與C組比較，P＜0.05 HIF-1α：缺氧誘導因子-1α

分組樣本量造模后第28天造模后第35天造模后第42天空白對照組(A)6 0.1237±0.0045 0.1242±0.0036 0.1247±0.0039模型對照組(B)6 1.2334±0.0152①1.1361±0.0285①1.0564±0.0165①中藥治療組(C)6 1.2043±0.0151①0.9260±0.0443①②0.7276±0.0280①②西藥治療組(D)6 0.4739±0.0559①②③0.4023±0.0356①②③0.3744±0.0170①②③F值201.339 128.281 59.098 P值＜0.001＜0.001＜0.001

表2 各組大鼠不同時間視網膜脈絡膜中Akt表達的平均光密度值s）

表2 各組大鼠不同時間視網膜脈絡膜中Akt表達的平均光密度值s）

注：同一時間多組間比較采用單因素方差分析，各組兩兩比較采用LSD法。①與A組比較，P＜0.05；②與B組比較，P＜0.05；③與C組比較，P＜0.05 Akt：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶

分組樣本量造模后第28天造模后第35天造模后第42天空白對照組(A)6 0.0441±0.0025 0.0421±0.0012 0.0412±0.0011模型對照組(B)6 0.6261±0.0111①0.6115±0.0047①0.5649±0.0265①中藥治療組(C)6 0.6176±0.0118①0.5480±0.0246①②0.4626±0.0338①②西藥治療組(D)6 0.2794±0.0122①②③0.2449±0.0133①②③0.2263±0.0219①②③F值459.820 211.406 57.471 P值＜0.001＜0.001＜0.001

圖3 各組BN大鼠第42天眼后部組織HE染色像。3A.空白對照組組（×400），可見視網膜結構完整；3B、3C、3D分別為模型對照組（×400）、中藥治療組（×200）和西藥治療組（×200），均可見視網膜結構破壞，內、外核層結構不連續。圖4各組BN大鼠第42天眼后部組織免疫組織化學染色像（HIF-1α，×200）。4A.空白對照組表達為陰性；4B、4C、4D分別為模型對照組、中藥治療組和西藥治療組，均被染成紅色或棕色，為陽性表達。圖5各組BN大鼠第42天眼后部組織免疫組織化學染色像（Akt，×200）。1A.空白對照組表達為陰性；5B、5C、5D分別為模型對照組、中藥治療組和西藥治療組，均被染成紅色或棕色，為陽性表達HIF-1α：缺氧誘導因子-1αAkt：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶

2.3 HIF-1α和Akt表達比較

A組各時間點視網膜脈絡膜的HIF-1α表達均為最低，其平均光密度值明顯低于其他各組（P＜0.05）。B組各時間點的HIF-1α表達的平均值則均為最高，造模后第28天時，C組HIF-1α表達的平均光密度值與B組接近（P＞0.05），D組數值低于B、C組（P＜0.05）；造模后第35、42天時，C組HIF-1α表達較前逐漸減少，其平均光密度值低于同期B組（P＜0.05），但始終高于D組（P＜0.05）（表1，圖4）。各組不同時間Akt表達的變化及組間差異情況與HIF-1α基本相同（表2，圖5）。

3 討論

目前，CNV的發病機制尚未明確，其形成過程有著非常復雜的病理生理機制。CNV的形成是一個復雜的多因子、多細胞參與的過程，如VEGF、HIF-1α、Akt等。其中，VEGF在CNV形成的過程中起著重要的作用[11]，其通過促進細胞內皮增生、血管基底膜和細胞外基質的降解以及內皮細胞的轉移而誘導新生血管的生成。HIF-1α信號通路是調控VEGF高表達的主要信號通路[5]；而Akt是調節表達的主要上游因子[6-7]。缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）是Semenza等[12]于1992年首次在低氧情況下的肝癌細胞株細胞核提取物中發現的低氧反應元件上的蛋白，被命名為HIF-1。HIF-1包括HIF-1α與HIF-1β兩個亞型，二者同屬于bHLH轉錄因子家族，HIF-1的活性及功能是由α亞基決定的，而β亞基可能與HIF-1的穩定性及其二聚體形成有關[13]。在正常條件下，細胞內HIF-1α可發生羥基化，被胞質中的蛋白水解酶成小分子片段，失去生物學功能，處于一種不斷合成與水解的動態平衡狀態，一般檢測到的極少[14]。在Akt轉導信號通路中，HIF-1α的活性可以由Akt來調節，它通過增加細胞內可用HIF蛋白池而提高轉錄活性，這一作用的產生是因為Akt信號通路可增加HIF-1α蛋白的合成速率[15]。在一定的條件誘導下，VEGF基因的HIF-1結合位點可與HIF-1α結合，并誘導VEGF轉錄，使其高表達[16]。VEGF的濃度升高，則促進了CNV的快速形成。

目前，CNV的治療方案主要為視網膜光凝、光動力學療法（photodynamic therapy,PDT）、玻璃體腔注射抗VEGF藥物、手術切除新生血管膜、黃斑轉位及聯合治療等[2,17-18]。玻璃體腔注射抗VEGF藥物被認為是目前治療CNV的主要方法，常用的藥物為康柏西普、雷珠單抗和貝伐單抗等。臨床已證實，雖該治療方法對于大部分患者短期療效肯定，但此治療方法復發率高，價格昂貴，其需要定期反復多次注射用藥，增加了眼內感染的風險，而且短期內有效，遠期效果欠佳。中醫藥以其“整體觀念”“辨證論治”的治療理念，在治療眼底病變等難治性眼病中凸顯優勢。

根據中醫學理論，由CNV引起的相關眼病屬于“視瞻昏渺”“瞳神絡病”[19]等范疇。中醫認為此類眼病多因稟賦不足或久視傷血、肝腎虧虛所致，氣血則生化乏源，目絡空虛，久則氣虛運化失司，津液代謝失常，又久病脾虛，濕濁內生，成痰或淤，血不養脈，日久則成“絡病”[19]，病絡易損而血溢絡外，出現視力障礙。此類眼疾病位深且病程長，久病易虛，病邪盤踞臟腑之絡，病情纏綿難愈，病邪易入難出，是治療本病的根本難點。

加減駐景方是在駐景丸基礎上經過多年臨床經驗形成的固定方劑，源于《中醫眼科六經要法》[20]，功用氣血陰陽共補，肝脾腎臟齊養，調暢絡脈，臨床治療CNV性眼病具有較好效果。前期研究結果提示加減駐景方可以抑制病理性近視視網膜脈絡膜中VEGF的表達而減少CNV的生成[21]。本實驗選擇目前較為成熟并廣泛應用的氪激光誘導BN大鼠CNV動物模型[8-10]，更深一步探討其抑制CNV的具體機制。該研究表明，B組各時間點HIF-1α和Akt的表達均高于A、C、D三組；C組各時間點HIF-1α和Akt的表達與B組比較，除造模后第28天組間差異無統計學意義（P＞0.05）外，造模后第35、42天兩種蛋白表達較模型組均減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；C組HIF-1α和Akt的表達各個時間點均高于D組，差異有統計學意義（P＜0.05）。由上可知，抗VEGF藥物（康柏西普眼用注射液）能有效的抑制HIF-1α和Akt的表達，且作用優于中藥組。但是中藥組（加減駐景方）在一定的程度上也可抑制HIF-1α和Akt的表達，從而抑制CNV。

綜上所述，加減駐景方可通過抑制視網膜、脈絡膜中HIF-1α和Akt的表達，從而減少CNV的形成，雖中醫藥短期療效差于西藥，藥效緩慢，但其價格低廉可長期服用，且副作用極少，本實驗結果為其治療CNV性眼病提供了用藥依據。

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Effect of Zhujing prescription on expression of HIF-1 alpha and Akt in choroidal neovascularization in rats

ZHOU Zhihao,KANGZefeng,LIU Jian,etal.
MedicalCollege ofQinghaiUniversity,Xining810001,China

OBJECTIVE To observe the effectofmodified Zhujing formula on the expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha(HIF-1α)and threonine kinase(Akt)in choroidalneovascularization(CNV)induced by krypton laser and to explore itsmechanism.METHODS Eighty-four Brown Norway(BN)rats(seven-week old,male) were randomly divided into fourgroups,namely normal controlgroup(group A,n=12),modelgroup(group B,n=24), modified Zhujing formula group(group C,n=24)and Conbercept treatmentgroup(group D,n=24).The righteyes of rats in group B,C and D underwent fundus krypton laser photocoagulation.Group Cwas treated withmodified Zhujing formula for21 days(10ml/kg/d),group Bwasadministrated intragastricallywith equivalentphysiologicalsaline and group D was treated by intravitreal injection of Conbercept21 days after photocoagulation.Examination of Fundusphotography,fundus fluorescein angiography,HE staining and immunohistochemistry were performed respectively 28 days,35 days and 42 days aftermodel establishment to observe the protein expression at different time points.RESULTS 1.For FFA performance:There was no fluorescence leakage in group A and the fluorescence leakage area in group Bwas larger than counterparts ofgroup C and group D ateach time point.While that in group Cwas larger than group D.2.For HE staining:At each time point, the retina and choroid structure ofgroup A was complete and continuous,but retina and choroid structure damage werefound in group B,C and D.3.Expression of HIF-1 and Akt:The expression of HIF-1αand Akt in the retinal choroidal in group A was the lowestateach time point(P<0.05)while their expression in group Bwas the highestamong allgroups.The expression of HIF-1αand Akt in group Cwas lower than that in group B atday 35 and 42(P< 0.05),butitwasalwayshigher than that in group D(P<0.05)atall time points.CONCLUSIONS Modified Zhujing formula prevented the growth of choroidal neovascularization(CNV)induced by krypton laser via inhibiting the expression ofHIF-1αand Akt.

modified Zhujing formula;choroidalneovascularization;hypoxia inducible factor-1 alpha;threonine kinase;conberceptophthalmic injection

R285.5

A

1002-4379（2017）02-0076-06

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.02.002

國家自然科學基金項目（81574032）

1青海大學研究生院，西寧810001 2中國中醫科學院眼科醫院，北京100040

亢澤峰，E-mail：zefeng2531@163.com