基于臥式厭氧裝置的稻秸高固態(tài)消化與甲烷菌變化研究

鄧玉營 阮文權(quán) 黃振興 繆恒峰 趙明星 施萬勝

(1．江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院，無錫214122;2．常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，常州213164; 3．江南大學(xué)江蘇省厭氧生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫214122)

基于臥式厭氧裝置的稻秸高固態(tài)消化與甲烷菌變化研究

鄧玉營1，2阮文權(quán)1，3黃振興1，3繆恒峰1，3趙明星1，3施萬勝1，3

(1．江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院，無錫214122;2．常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，常州213164; 3．江南大學(xué)江蘇省厭氧生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫214122)

針對單一稻秸高固態(tài)厭氧消化長期運(yùn)行不穩(wěn)的問題，接種瘤胃內(nèi)含物和厭氧污泥，在臥式反應(yīng)裝置中研究3個(gè)有機(jī)負(fù)荷(OLR)下消化特性。結(jié)果表明，體系最高容積產(chǎn)氣率達(dá)到了1.04 L/(L·d)。當(dāng)OLR為2.26 g/(L·d)時(shí)，甲烷體積分?jǐn)?shù)均值為54.39%，甲烷產(chǎn)率為280.90m L/g，達(dá)到了稻秸理論產(chǎn)值的80.29%。臥式裝置中半纖維素和纖維素最高降解率分別達(dá)到了49.71%和31.25%;纖維素酶活性顯著提高，有利于纖維素的降解。當(dāng)OLR升高到2.47 g/(L·d)時(shí)，氨氮質(zhì)量濃度均值達(dá)到了1 082.63mg/L。固體樣品中嗜氫型Methanobacteriales數(shù)量從1.70× 109拷貝數(shù)/g下降至1.04×106拷貝數(shù)/g;而嗜乙酸型Methanosarcinales數(shù)量從7.89×106拷貝數(shù)/g增加至9.44× 106拷貝數(shù)/g，甲烷產(chǎn)率下降為256.54mL/g。此時(shí)厭氧裝置中丙酸質(zhì)量濃度均值達(dá)到了253.32mg/L。從而明確了稻秸高固態(tài)體系中產(chǎn)甲烷菌結(jié)構(gòu)的變化。

臥式反應(yīng)裝置;稻秸;高固態(tài)消化;甲烷菌群

引言

秸稈是含有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等有機(jī)組分植物生物質(zhì)的統(tǒng)稱。CHANDRA等［1］分析了秸稈的多種生物轉(zhuǎn)化途徑，認(rèn)為秸稈厭氧消化產(chǎn)甲烷比預(yù)處理后產(chǎn)酒精更具優(yōu)勢。而且沼氣工程還可以減少秸稈焚燒、獲得沼渣沼肥，綜合效益顯著。一般來講，厭氧消化根據(jù)含固率的不同，分為濕式(L-AD)、半固態(tài)(S-AD)和固態(tài)(SS-AD)，分別以含固率10%、10%～20%和大于20%來劃分［2］。也有研究將含固率15%作為劃分L-AD和SS-AD的標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)秸稈沼氣工程含固率大多在6%～8%之間，容積產(chǎn)氣率在0.8m3/(m3·d)左右。而高固態(tài)消化工藝緩解了濕式消化存在的結(jié)殼和分層現(xiàn)象，因此被認(rèn)為更適合秸稈的厭氧消化［3］。常見的有車庫型工藝［4］、高溫的Dranco和Kompogas工藝［5］及中溫的Valorga工藝［6］。商業(yè)化運(yùn)行的高固態(tài)厭氧工藝能顯著提高容積產(chǎn)氣率和經(jīng)濟(jì)效益。

但高固態(tài)工藝影響沼液的流變狀態(tài)［7］，易造成代謝物擴(kuò)散障礙［8］等問題。出現(xiàn)揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)積累，從而造成體系“酸中毒”現(xiàn)象［9］。研究者常通過提高接種比［10］和沼液回流等［11］措施強(qiáng)化厭氧菌群，實(shí)現(xiàn)厭氧消化效率的提高。但長期運(yùn)行中出現(xiàn)有毒物質(zhì)積累［12－13］、氨氮抑制［14－15］等問題，影響甲烷菌和產(chǎn)甲烷活性，導(dǎo)致沼氣反應(yīng)器運(yùn)行不穩(wěn)［16］。在單一稻秸高固態(tài)體系中，厭氧消化特性研究較少;定量分析甲烷菌數(shù)量及類型是研究其適應(yīng)性變化的有效手段，但未見相關(guān)報(bào)道。

為此，本研究利用臥式高固態(tài)反應(yīng)裝置，接種瘤胃內(nèi)含物和厭氧污泥，維持含固率在(15±2)%，考察長期運(yùn)行中，稻秸高固體厭氧消化特性;并借助絕對定量PCR(Q-PCR)技術(shù)，揭示甲烷菌群在不同有機(jī)負(fù)荷下的適用性變化。

1 材料和方法

1.1 接種物與秸稈原料

接種用厭氧污泥來源于處理餐廚廢棄物的厭氧反應(yīng)器(江蘇潔凈環(huán)境技術(shù)有限公司，中國)。從無錫生牛屠宰場收集新鮮瘤胃內(nèi)含物(包括粗料)，與厭氧污泥按揮發(fā)性固體質(zhì)量比1∶1混合，以獲得高效厭氧菌群。稻秸在50℃干燥箱中至恒質(zhì)量，用400型鍘草粉碎機(jī)(麗麗食品機(jī)械設(shè)備，中國)粉碎后過20目篩保存在塑料干燥袋中備用。接種物和稻秸的主要特性如表1所示。

1.2 反應(yīng)裝置運(yùn)行

為保證高固態(tài)進(jìn)出料和沼液的均質(zhì)化，本研究設(shè)計(jì)臥式高固態(tài)反應(yīng)裝置(圖1)。進(jìn)出料采用螺帶式，保證高固態(tài)物料的輸送。通過罐體中間攪拌軸緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)使沼液形成垂直混合和水平推流的復(fù)合流態(tài)。采用伴熱帶(北京中海華光電伴熱技術(shù)公司，中國)加熱，100mm厚的玻璃棉氈進(jìn)行罐體保溫，使用LML-1濕式氣體流量計(jì)(長春汽車濾清器有限公司，中國)進(jìn)行沼氣體積測定。

圖1 臥式反應(yīng)裝置Fig．1 Horizontal reactor

采用全接種半連續(xù)進(jìn)出料的運(yùn)行方式［10］，攪拌軸轉(zhuǎn)速5 r/min，料液有效體積190 L。接種泥接入反應(yīng)器后馴化10 d，產(chǎn)氣穩(wěn)定后正式運(yùn)行。根據(jù)有機(jī)負(fù)荷(OLR)的不同分為3個(gè)階段，分別為1.89、 2.26、2.47 g/(L·d)，為保持體系含固率在(15± 2)%范圍內(nèi)波動(dòng)，每兩天排沼液量分別設(shè)為2.56、3.05、3.41 kg，每個(gè)階段運(yùn)行72 d。沼液倒入100目濾網(wǎng)袋，放入脫水裝置(海爾，中國)中甩干。固渣用于組分分析;沼液留樣后，按照自來水與沼液比0.58∶1來補(bǔ)充損失水分，回流至反應(yīng)器中。每2 d記錄一次沼氣體積，并用Gasboard-3200L型紅外甲烷測定儀(武漢四方光電科技有限公司，中國)分析甲烷含量。

1.3 理化指標(biāo)分析

沼液總固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)(TS)和揮發(fā)性固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)(VS)根據(jù)APHA規(guī)定的方法測量［17］。沼渣于105℃干燥后研磨過100目篩網(wǎng)，在VarioEL元素分析儀(Elementar，德國)中測定稻秸C、N、H及S含量，O元素含量通過總值減去其它元素比例得到;并每8 d測定一次總樣品碳氮比。固渣組分變化用A2000i型纖維分析儀(ANKOM，美國)測定，分析過程中中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)及酸不溶性木質(zhì)素(ADL)殘?jiān)荚?5℃干燥箱中干燥至質(zhì)量恒定;每個(gè)運(yùn)行階段測定8個(gè)樣品。

沼液5 000 r/min離心15min，用超純水稀釋后用于氨氮、水解酶活、VFAs濃度及總揮發(fā)性脂肪酸和堿度比(TVFA/TIC)測定，每個(gè)樣品重復(fù)3次。氨氮濃度使用納氏法測定［17］。纖維素酶和木聚糖酶活性根據(jù)SAMBUSITI等［18］的方法測定，單位為U/mL。每毫升每分鐘上清液釋放1μg葡萄糖(木糖)的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。樣品在VFAs測定前按同體積與0.83 g/L 4-甲基戊酸和3mol/L磷酸混合后，4 800 r/min離心10 min;所得上清使用GC-2010 Plus(島津，日本)測定VFAs濃度，溫度設(shè)定參照LIU等［19］的方法。

為及時(shí)反映體系運(yùn)行狀況，采用兩點(diǎn)滴定法測定TVFA/TIC比值［20］:使用0.05mol/L硫酸作為標(biāo)準(zhǔn)液，滴定經(jīng)稀釋的沼液，分別記錄滴定至pH值5.0和4.4時(shí)的耗硫酸量。總揮發(fā)性脂肪酸質(zhì)量濃度(TVFA)和堿度(TIC)計(jì)算式為

式中 V——體積，為30mL

MVFA——pH值從5.0滴定至4.4所耗硫酸量，mL

MTIC——pH值滴定至5.0時(shí)所耗硫酸量，mL

1.4 甲烷菌絕對定量Q-PCR

每個(gè)階段選取3個(gè)樣品用于DNA提取，提取步驟按照Power soil DNA試劑盒(Mo Bio，美國)說明書操作。以表2［21］中引物分別對同一個(gè)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)?95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次;最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，切膠回收;直接與pMD19-T載體連接，熱擊轉(zhuǎn)化并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。提取陽性質(zhì)粒DNA，送蘇州金唯智生物有限公司(蘇州，中國)測序鑒定。用紫外分光光度計(jì)測定質(zhì)粒DNA濃度，并計(jì)算各目標(biāo)甲烷菌拷貝數(shù)

式中 A——基因片段濃度

B——基因片段長度

表2 絕對定量Q-PCR引物序列和片段長度Tab．2 Primer sequences and fragment sizes of absolute quantitative Q-PCR

質(zhì)粒按10倍梯度稀釋成109～103拷貝數(shù)/μL系列模板，以SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(大連寶生物，中國)試劑建立10μL反應(yīng)體系，其中正反引物(10μmol/L)各0.4μL、質(zhì)粒模板2μL。每個(gè)樣品重復(fù)3次，反應(yīng)程序參考STEINMETZ等［21］的方法設(shè)定。按Step One PCR儀操作自動(dòng)采集熒光，獲得每個(gè)PCR反應(yīng)的閾值(Ct)。建立質(zhì)粒拷貝數(shù)濃度與Ct值的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)每個(gè)樣品中檢測的Ct值，計(jì)算目標(biāo)甲烷菌的數(shù)量，結(jié)果用每克固體樣品中甲烷菌的拷貝數(shù)來表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 19.0軟件(IBM，美國)單因素方差分析(ANOVA)來確定顯著性差異，p=0.05作為閾值水平;對碳氮比及氨氮濃度進(jìn)行皮爾遜(Pearson’s)相關(guān)性分析。計(jì)算其理論甲烷潛力(M)［22］。

式中a、b、c、d、e為稻秸分子通式CaHbOcNdSe下標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 沼氣及甲烷產(chǎn)生

沼氣產(chǎn)量和甲烷體積分?jǐn)?shù)如圖 2a所示，第1階段，在10～18 d時(shí)，沼氣產(chǎn)量出現(xiàn)了1個(gè)峰值，在208～218.5 L/d范圍內(nèi)變動(dòng)。而甲烷體積分?jǐn)?shù)在57.13%～61.38%范圍內(nèi)變動(dòng)。隨后甲烷含量下降，在32 d時(shí)，達(dá)到最低值45.26%。從第50天開始甲烷體積分?jǐn)?shù)穩(wěn)定在 51.02% ～55.95%范圍內(nèi)。

圖2 不同有機(jī)負(fù)荷下沼氣產(chǎn)量、甲烷體積分?jǐn)?shù)和甲烷產(chǎn)率的變化Fig．2 Dynamic changes of biogas yields and CH4content，CH4productivities at different OLR

第1階段同樣在10～18 d時(shí)出現(xiàn)了產(chǎn)甲烷峰值(圖2b)，隨后甲烷產(chǎn)率下降，在32 d附近降至271.85mL/g，50 d后甲烷產(chǎn)率保持穩(wěn)定，最終甲烷產(chǎn)率均值達(dá)到了321.88mL/g。該階段產(chǎn)甲烷的變化可以用厭氧消化底物的變化來解釋。由于采用全接種，接種比例高。瘤胃接種物中包含內(nèi)源蛋白、可溶性多糖等易降解物質(zhì)，能首先被利用。而碳水化合物通式為(C6H10O5)n，蛋白質(zhì)通式為(C5H7O2)n，根據(jù)Buswell方程［3］，它們產(chǎn)生沼氣的理論甲烷體積分?jǐn)?shù)分別為50%和60%。因此首先出現(xiàn)的產(chǎn)氣峰和高比例的甲烷含量，主要來源于內(nèi)源蛋白的降解。當(dāng)該類物質(zhì)逐漸被消耗，在32 d時(shí)甲烷含量和甲烷產(chǎn)率降至最低。從50 d開始，隨著秸稈的水解，種間氫傳遞加快，產(chǎn)甲烷活性增強(qiáng)，甲烷產(chǎn)率維持穩(wěn)定。

第2階段，隨著有機(jī)負(fù)荷由1.89 g/(L·d)提高到2.26 g/(L·d)，甲烷體積分?jǐn)?shù)在 53.01% ～56.16%之間變動(dòng)，稻秸水解產(chǎn)甲烷活性增強(qiáng)，甲烷產(chǎn)率均值穩(wěn)定在280.90 mL/g，與經(jīng)過各種預(yù)處理后厭氧消化的產(chǎn)率(92～280 mL/g)相比，優(yōu)勢明顯［23］。元素分析儀測定結(jié)果表明，C、N、H、S及O元素的比例分別為 0.85%、40.10%、5.94%、0.07%及53.03%，從而求出稻秸通式為C54.88H97.62O54.43NS0.04。計(jì)算其理論甲烷產(chǎn)率為349.86mL/g，本階段甲烷產(chǎn)率達(dá)到了理論產(chǎn)值的80.29%。

第3階段，隨著有機(jī)負(fù)荷提高到2.47 g/(L·d)，甲烷含量在152～170 d有明顯的下降，最低值只有49.25%(圖2a)，整個(gè)階段甲烷體積分?jǐn)?shù)均值為52.36%。如圖2b所示，甲烷產(chǎn)率首先下降，在166 d降至230.49 mL/g，然后又有所升高，均值為256.54mL/g。3個(gè)階段容積產(chǎn)氣率逐漸提高，分別達(dá)到了0.98、1.01、1.04 L/(L·d)(表3)。

表3 臥式反應(yīng)裝置運(yùn)行參數(shù)及水解酶活變化Tab．3 Changes of operational parameters and hydrolytic activities in the horizontal reactor

稻秸高固態(tài)條件下高效產(chǎn)甲烷可以從幾方面來解釋。首先，高固態(tài)消化需要更多的接種物，而本研究采用全接種方式提高了水解、產(chǎn)甲烷等功能菌群的數(shù)量，有利于稻秸的厭氧消化。如 FORSTERCARNEIRO等［10］在消化食品廢棄物時(shí)，全接種方式同樣提高了消化效率及甲烷產(chǎn)率。其次，稻秸復(fù)雜的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其水解困難，是整個(gè)消化的限速步驟［22］。而瘤胃內(nèi)含物中含有大量的水解菌群，有利于提高水解效率［24］。另外，厭氧污泥的加入提高了甲烷菌的數(shù)量，加速了種間氫傳遞和嗜乙酸型產(chǎn)甲烷過程［25］。如在稻秸瘤胃厭氧消化中，研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷污泥的投加能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)甲烷效率的提高［26］。

2.2 TVFA/TIC比值及VFAs的變化

VFAs的積累易造成酸化，但體系中存在的碳酸鹽、重碳酸鹽及少量氨氮緩沖了VFAs的影響，這種緩沖能力可以用堿度來表示。根據(jù)RAPOSO等［27］的報(bào)道，厭氧體系最理想的堿度范圍為2 500～5 000mg/L，能緩沖VFAs濃度升高造成的影響，使pH值在小范圍內(nèi)變化。由此可見，pH值對體系VFAs積累有一定的遲滯性;而TVFA/TIC比值常用于衡量體系緩沖能力，能及時(shí)預(yù)警酸化現(xiàn)象。當(dāng)比值低于0.4時(shí)，表明體系產(chǎn)酸與產(chǎn)甲烷達(dá)到平衡，體系穩(wěn)定;當(dāng)比值高于0.8時(shí)，體系發(fā)生酸化現(xiàn)象［28］。

如圖3所示，本研究中前2個(gè)階段，TVFA/TIC平均比值都為0.11，第3階段比值為0.16，表明反應(yīng)運(yùn)行都在穩(wěn)定范圍內(nèi)。同時(shí)TVFA/TIC比還可以用于分析OLR的高低:比值在0.3～0.4之間有最佳的產(chǎn)甲烷效率;比值小于0.3或大于0.4表明負(fù)荷過低或過高［28］。從TVFA/TIC實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看，本研究第3階段OLR并不過載，不是導(dǎo)致甲烷產(chǎn)率下降的原因。

圖3 TVFA/TIC比及VFAs質(zhì)量濃度的變化Fig．3 Dynamic changes of TVFA/TIC ratio and VFAs concentrations

本研究中VFAs主要包括了乙酸、丙酸和丁酸。由于瘤胃接種物的影響，第1階段存在VFAs積累現(xiàn)象，乙酸、丙酸和丁酸的平均質(zhì)量濃度分別為597.82、218.01、126.11 mg/L。隨著產(chǎn)甲烷活性的提高，第2階段VFAs積累減弱，質(zhì)量濃度分別為33.44、188.46、65.43 mg/L。但隨著第3階段有機(jī)負(fù)荷的提高，丙酸開始積累，平均質(zhì)量濃度達(dá)到了253.32mg/L。尤其從第188天開始，濃度顯著提高，在268.7～372mg/L之間變動(dòng)。

LERM等［29］在分析不同OLR條件下產(chǎn)酸代謝途徑時(shí)發(fā)現(xiàn)，OLR升高會(huì)引起丁酸氧化加快，但超過了甲烷菌的代謝能力時(shí)，氫和還原性NADH不能及時(shí)利用，只能通過產(chǎn)丙酸途徑獲得釋放。為此AHRING等［30］提出VFAs的濃度和種類，尤其是丙酸和丁酸是產(chǎn)甲烷受抑制的重要指標(biāo)。本研究第3階段丙酸的積累同樣說明產(chǎn)甲烷活性受到抑制，甲烷產(chǎn)率從第2階段的280.90 mL/g降至256.54 mL/g (表3)。

2.3 碳氮比及氨氮質(zhì)量濃度變化

氮是微生物重要的營養(yǎng)物質(zhì)，根據(jù)MUSSOLINE等［23］的報(bào)道，碳氮比在25～35之間有利于厭氧消化。而單一稻秸原料碳氮比為46.96，含氮量低(表1)，導(dǎo)致其生物可降解性差。但共接種物中瘤胃內(nèi)含物與厭氧泥碳氮比較高，分別為12.48和7.36。采用沼液回流工藝，氮損失較少，可以滿足微生物對氮源的需要［11，23］。如圖4所示，3個(gè)階段的碳氮比分別在 16.70～19.95、17.82～20.15及20.27～23.93之間變動(dòng)。雖然比值顯著升高(p＜0.05)，但整個(gè)過程完全能滿足厭氧消化的需要。通過Pearson’s相關(guān)性分析，碳氮比與氨氮質(zhì)量濃度密切相關(guān)(p＜0.01)。氨氮質(zhì)量濃度在3個(gè)階段同樣逐漸升高，均值分別為877.74、950.80、1 082.63mg/L。尤其在第3階段，裝置運(yùn)行192 d后，氨氮最高濃度達(dá)到了1 196.37 mg/L。體系氨氮質(zhì)量濃度的升高與厭氧微生物的代謝有關(guān)。由于接種物中部分微生物無法適應(yīng)環(huán)境而衰亡，導(dǎo)致胞內(nèi)有機(jī)氮分解釋放到沼液中。這在厭氧消化玉米秸［14］、混合秸稈［15］的回流工藝中同樣出現(xiàn)。本研究中第3階段氨氮質(zhì)量濃度盡管沒有超過產(chǎn)甲烷抑制的閾值濃度1 500mg/L［3，31］，但高的氨氮濃度會(huì)對嗜氫型和嗜乙酸型甲烷菌產(chǎn)生不同影響，并抑制產(chǎn)甲烷活性［25，32］。

圖4 碳/氮比及氨氮質(zhì)量濃度變化Fig．4 Changes of C/N ratio and-N concentrations

2.4 稻秸組分及水解酶活變化

如圖5所示，3個(gè)階段中沼渣中半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.89%、8.67%、9.69%;纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20.88%、17.58%、19.44%;木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為17.50%、17.69%、18.27%。和稻秸原料各組分相比，半纖維素的降解率分別為42.62%、49.71%、43.79%，纖維素降解率分別為18.34%、31.25%、23.99%。半纖維素的降解率比纖維素高，兩者在第2階段都有最高的降解率，與甲烷產(chǎn)率一致。這也說明了水解過程仍然是秸稈厭氧消化的限速步驟［33］，而高的降解率有利于產(chǎn)甲烷效率的提高。由于降解木質(zhì)素的苯丙烷結(jié)構(gòu)時(shí)需要底物氧，因此木質(zhì)素在厭氧條件下難以降解［1，23］。本研究各階段中木質(zhì)素含量比稻秸原料都略有升高，同樣說明其不能被厭氧菌所利用。

圖5 稻秸組分質(zhì)量變化率Fig．5 Dynamic changes of rice straw components

水解酶活是表征秸稈水解特性的重要指標(biāo)，在厭氧條件下主要包括了木聚糖酶和纖維素酶。如表3中所示，木聚糖酶活顯著升高(p＜0.05)，第3階段達(dá)到了最大值287.09 U/mL。而纖維素酶在第2階段有最高值2 632.18 U/mL，第3階段有所下降，和稻秸纖維素降解率一致。

從秸稈的結(jié)構(gòu)來看，纖維素被木質(zhì)素和半纖維素共價(jià)形成的基質(zhì)包裹，阻止了水解酶的降解［1，23］。本研究中高半纖維素降解率有利于暴露出微纖維結(jié)構(gòu)，利于水解酶對內(nèi)部纖維素成分的降解［34］。在高粱青貯飼料厭氧消化中，SAMBUSITI等［18］也認(rèn)為木聚糖酶活峰值早于纖維素外切酶活，實(shí)現(xiàn)了對高粱不同組分的協(xié)同降解，加快了水解過程。另一方面，臥式反應(yīng)裝置的運(yùn)行方式增加了未降解固渣的停留時(shí)間，同樣有利于纖維素酶的水解作用，使得纖維素酶活顯著高于木聚糖酶活。

2.5 不同類型甲烷菌數(shù)量的變化

3個(gè)陽性克隆片段大小同預(yù)期結(jié)果基本一致，與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的菌群序列相似性為100%，分別利用重組質(zhì)粒構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中總甲烷菌拷貝數(shù)(X)與Ct值(Y)的回歸方程為:Y=－3.436lg X+41.072，決 定 系 數(shù) R2=0.987; Methanosarcinales拷貝數(shù)(X)與Ct值(Y)的回歸方程為:Y=－3.135lg X+39.172，決定系數(shù)R2=0.987 3; Methanobacteriales拷貝數(shù)(X)與Ct值(Y)的回歸方程Y=－3.472lg X+40.885，決定系數(shù)R2=0.987。其中X單位為拷貝數(shù)/μL。從而計(jì)算出3個(gè)階段每克固體樣品中甲烷菌的拷貝數(shù)。

Methanobacteriales 包 括 Methanobacterium、Methanobrevibacter及Methanosphaera等嗜氫型甲烷菌，是典型瘤胃甲烷菌。而嗜乙酸型Methanosarcinales包含了Methanosarcina等甲烷菌菌屬［25］。通過兩類不同營養(yǎng)型甲烷菌的變化，可以分析環(huán)境因素對產(chǎn)甲烷途徑的影響［21］。如表4所示，固體樣品中總甲烷菌拷貝數(shù)逐漸降低，但在第2、3階段差別不大。Methanobacteriales拷貝數(shù)在3個(gè)階段中逐漸降低，分別為1.20×1010、1.70×109、1.04× 106拷貝數(shù)/g。而 Methanosarcinales拷貝數(shù)逐漸升高，在第3階段數(shù)量高于Methanobacteriales。

表4 不同階段甲烷菌數(shù)量的變化Tab．4 Changes ofmethanogens at different stages 拷貝數(shù)/g

前兩個(gè)階段，主要甲烷菌類型為嗜氫型的Methanobacteriales，稻秸水解產(chǎn)生的氫通過種間氫傳遞實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)甲烷活性的提高。在稻秸瘤胃和厭氧污泥共培養(yǎng)研究中，同樣發(fā)現(xiàn)體系中Methanobrevibacter成為優(yōu)勢菌屬，與瘤胃水解菌能形成功能菌群。從而實(shí)現(xiàn)了水解和產(chǎn)甲烷活性的提高［26］。

但厭氧消化中甲烷菌易受到環(huán)境條件的影響［16］。Methanobacteriales菌屬大多呈桿狀結(jié)構(gòu)，倍增時(shí)間較長，易受到氨氮的抑制。高濃度氨氮產(chǎn)生的游離氨自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞膜，破壞K+依賴型ATP離子泵的運(yùn)行［32，35］，從而對微生物產(chǎn)生毒害。而Methanosarcinales結(jié)構(gòu)是不規(guī)則的球菌，常形成包囊或聚合體結(jié)構(gòu)，倍增時(shí)間短，對環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)［25］。本研究第 3階段，氨氮質(zhì)量濃度達(dá)到1 082.63mg/L時(shí)，嗜氫型的Methanobacteriales受到抑制，數(shù)量下降為1.04×106拷貝數(shù)/g，產(chǎn)甲烷活性隨之降低。水解產(chǎn)生的還原氫不能被甲烷菌及時(shí)利用，造 成 丙 酸 積 累［29］。而 嗜 乙 酸 型 的Methanosarcinales受到的抑制小，拷貝數(shù)反而增加至9.44×106拷貝數(shù)/g，成為主要甲烷菌類型，產(chǎn)甲烷途徑發(fā)生變化。

3 結(jié)論

(1)臥式厭氧裝置3個(gè)階段的容積產(chǎn)氣率分別達(dá)到了0.98、1.01、1.04 L/(L·d)。當(dāng)?shù)窘誒LR為2.26 g/(L·d)時(shí)，甲烷體積分?jǐn)?shù)在 53.01% ～56.16%之間變動(dòng)，甲烷產(chǎn)率為280.90mL/g。

(2)第1階段受到接種物的影響，VFAs存在積累現(xiàn)象。當(dāng)OLR升高到2.47 g/(L·d)時(shí)，體系丙酸積累，平均質(zhì)量濃度達(dá)到253.32 mg/L;氨氮質(zhì)量濃度升高到1082.63 mg/L，甲烷產(chǎn)率降至256.54mL/g。

(3)3個(gè)階段半纖維素的降解率分別為42.62%、49.71%、43.79%;纖維素降解率分別為18.34%、31.25%、23.99%。木聚糖酶在第3階段達(dá)到了最大值287.09 U/mL;而纖維素酶在第2階段達(dá)到了最大值2 632.18 U/mL。

(4)3個(gè)階段中不同類型甲烷菌數(shù)量和比例發(fā)生了變化。固體樣品中Methanobacteriales數(shù)量逐漸降低，分別為1.20×1010、1.70×109、1.04×106拷貝數(shù)/g;而適應(yīng)性強(qiáng)的Methanosarcinales數(shù)量逐漸增加，分別為4.24×106、7.89×106、9.44×106拷貝數(shù)/g。

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High Solid-state Digestion of Rice Straw and Changes of Methanogens in Horizontal Anaerobic Reactor

DENG Yuying1，2RUANWenquan1，3HUANG Zhenxing1，3MIAO Hengfeng1，3ZHAO Mingxing1，3SHIWansheng1，3
(1．School of Environmental and Civil Engineering，Jiangnan University，Wuxi214122，China 2．Changzhou Vocational Institute of Engineering，Changzhou 213164，China 3．Jiangsu Key Laboratory of Anaerobic Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

Instability of high solid-state anaerobic digestion often happened during the long-term operation of reactor．To investigate underlying methanism of this problem，the characteristics of semi-continuous anaerobic digestion for rice straw were studied with three organic loading rates(OLR)in a horizontal reactor，when being co-inoculated with ruminal contents and anaerobic sludge．The results indicated that the highest volume biogas production reached 1.04 L/(L·d)in the reactor．The average CH4productivity reached 280.90mL/g VSwith 54.39%CH4volume content at the OLR of2.26 g/(L·d)，which was up to 80.29%of the theoretical value of rice straw．The highest digestion rates of hemicellulose and cellulose were 49.71%and 31.25%，respectively．And the cellulase activities were increased obviously in the horizontal reactor，which was indispensable to the degradation of cellulose．At the OLR of2.47 g/(L·d)，the average concentration of ammonium nitrogen reached 1 082.63 mg/L．Especially the highest concentration reached 1 196.37 mg/L after 192 d of operation．It was indicated that the methanogens suffered different influences from ammonium nitrogen using quantitative real-time PCR(Q-PCR)．Specifically，the hydrogenotrophic Methanobacteriales was decreased to 1.04×106copies/g from 1.70× 109copies/g dominated in the solid residues and CH4productivity was decreased to 256.54mL/g for being inhibited significantly．In contrast，the acetotrophic Methanosarcinales was increased to 9.44×106copies/g from 7.89×106copies/g．At the same time，the average propionate concentration reached 253.32mg/L in the anaerobic reactor．Thus the study revealed the adaptive shifts of underlyingmethanogenic communities by ammonium nitrogen inhibition during the high solid-state digestion of rice straw．

horizontal reactor;rice straw;high solid-state digestion;methanogenic community

S216.4

A

1000-1298(2017)07-0272-08

2017-05-16

2017-05-31

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51678279、21506076)、“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAC25B01)和常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院校級科研基金項(xiàng)目(11130100116022)

鄧玉營(1978—)，男，博士生，常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，主要從事秸稈厭氧發(fā)酵研究，E-mail:8000000577@czie．edu．cn

阮文權(quán)(1966—)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事大型厭氧工程設(shè)計(jì)及運(yùn)行研究，E-mail:wqruanjn@gmail．com

10．6041/j．issn．1000-1298．2017．07．034