紫花苜蓿資源抗旱性鑒定評價方法研究

趙海明， 游永亮， 李 源， 柳斌輝， 劉貴波*， 武瑞鑫， 王桂峰

(1.河北省農林科學院旱作農業研究所， 河北省農作物抗旱研究重點實驗室, 河北 衡水 053000； 2.衡水市農牧局土肥站， 河北 衡水 053500)

開展紫花苜蓿(MedicagosativaL.)的抗旱性鑒定評價技術研究, 對于篩選抗旱種質、培育抗旱節水苜蓿品種具有重要意義。紫花苜蓿種質資源的抗旱性評價，應力求簡單快速而且科學準確，首先鑒定評價指標的選擇尤為關鍵；其次選擇合適的評價方法同樣重要。在選擇評價方法時，既要考慮統計方法，又要考慮評價的目的。在統計方法方面，一般采用方差分析字母標記法，但是只適用于鑒定資源份數較少的情況，一般不能超過50份，如果種質資源數量更多，必須采用更合理方法進行統計分析。目前有關大豆(Glycinemax)、水稻(Oryza.sativaL.)等農作物的統計方法很多[1-3]，如平均抗旱系數[4]、隸屬函數法[5]、抗旱指數[6]、存活率[7]等；苜蓿常用的有隸屬函數法[8-10]、主成分分析法[11]、聚類分析法[11,12]、分級賦分法[13]等。不同評價目的，抗旱性篩選結果有所不同。常見的評價目的主要有3類，一是篩選在干旱和灌溉條件下均高產的抗旱品種[1,14-15]，二是篩選旱地條件下高產品種[1]，二者均考慮了豐產性，三是篩選自身抗旱性強的種質資源[16]，這種資源具有某種抗旱基因，在抗旱遺傳育種等研究中用途更廣，3種方法的評價結果不一樣，因此需要選擇不同的統計方法進行評價，滿足生產和科研需要。

在明確采取何種評價方法基礎上，苜?？购敌约墑e的劃分，目前尚無規范標準。玉米(ZeamaysL.)抗旱性鑒定技術規范(DB13T_1282-2010)[17]規定了玉米萌發期采用耐旱指數、苗期采用存活率、花期、灌漿期、全生育期采用抗旱指數劃分標準進行劃分，小麥(TriticumaestivumL.)[18]和大豆[19]抗旱性鑒定技術規范(GB/T 21127-2007和DB11T720-2010)芽期均采用相對發芽率、苗期均采用存活率、全生育期分別采用抗旱指數和抗旱系數劃分標準進行劃分；路貴和提出的逐級分類法可把任何參試材料分為5類[15]，但是該方法如果沒有標志性對照，則無法判斷該批材料抗旱水平，可能為極抗旱，也可能為極不抗旱類型。在判定抗旱級別的方法上，肖玉龍、楊瑞芳、徐向南通過調查植株萎蔫程度直接進行劃分[20-22]。

針對以上問題，本文借鑒其他農作物大量種質資源的抗旱研究經驗，對引進的176份苜蓿種質資源，采用盆栽方法，開展了苜蓿苗期抗旱性鑒定篩選，進行了抗旱鑒定指標(調查指標)的篩選；同時對多種抗旱評價方法(抗旱系數等)進行了比較探討，力求總結出一套簡便易行、針對性強的苜?？购敌澡b定評價方法，為苜蓿資源的抗旱性鑒定和抗旱育種提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為176份苜蓿種質資源，由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所提供，敖漢苜蓿為對照品種。

表1 種質資源編號Table 1 Germplasm resources code number

1.2 試驗地點

試驗于2015年8-11月在河北省深州市河北省農林科學院旱作農業節水試驗站日光溫室內進行，溫室內溫度控制在20℃～30℃。

1.3 試驗方法

試驗采用盆栽反復干旱法，設置水處理、旱處理2個處理，水處理正常供水為對照，每個處理4次重復，采用無孔塑料箱(48.5 cm × 33.3 cm × 18 cm)作為盆栽容器，同時以裝滿培養土的空白箱作對照用以觀測土壤水分變化情況，播種、澆水同正常處理。每箱播種4份材料，每份材料定苗20株；水處理始終保持土壤水分為田間持水量的80%；旱處理幼苗長至三葉期時停止供水，開始干旱脅迫，直至脅迫后幼苗連續萎蔫約7 d，脅迫天數約30 d，當土壤含水量降至田間持水量的15%～20%(土壤含水量約3.3%～5.2%)時復水，使復水后的土壤水分達到田間持水量的80%，復水5 d后調查存活苗數，以葉片轉呈鮮綠色者為存活，第1次復水后即停止供水，開始第2次干旱脅迫，連續進行2次。

1.4 培養土準備

將中等肥力的耕層土與沙土均過篩后，按1∶1比例混勻，然后裝入無孔塑料箱中壓實，裝土厚度15 cm；同時取土樣測定土壤含水量(17.89%)以確定實際裝入干土重；測定土壤養分含量，結果為速效氮42.0 mg·kg-1，速效磷8.5 mg·kg-1，速效鉀146.6 mg·kg-1，有機質含量1%，全鹽含量0.062%，pH值8.02。

1.5 播種及苗期管理

每份材料挑選顆粒飽滿、大小一致的種子80～100粒。播前灌水至土壤田間持水量的80%(土壤含水量約20.8%)，適墑點播，播前保持土壤平整；每箱播種4份材料，不同材料之間間距為8.3 cm，單株面積為3.5 cm × 4 cm，株行距均勻分布，每穴4～5粒，播后覆土1.5 cm。三葉期前每份材料留健壯、均勻的幼苗20株，試驗期間通過測定土壤含水量及時補充蒸發損失的土壤水分。本試驗8月18日播種，9月12日開始脅迫，10月6日第1次復水，11月3日第2次復水。

1.6 鑒定指標及測定方法

地上生物量：收集地上部分殺青后80℃烘干至恒重為止；

地下生物量：收集地下部分洗凈、殺青后 80℃烘干至恒重為止；

株高：測量所有植株株高，從主莖莖基部直到心葉頂端，求平均值。

根長：在調查地下生物量時，選取10株典型植株測量主根長度；

分枝數：試驗結束時調查所有植株，各單株主莖一級分枝數目；

根冠比：地下生物量與地上生物量的比值。

1.7 抗旱性評價方法

1.7.1抗旱性直接評價 以地上生物量、地下生物量、株高、分枝數、根冠比等調查指標為依據，分別計算脅迫強度[1]、抗旱系數[1]、抗旱指數值[23]，采用地上生物量計算傷害指數[1]、敏感指數[1]、抗旱性指數[1]、抗旱指數[1]、改進抗旱指數[2]、耐旱指數[2]，比較分析各種方法間的相關性, 選擇科學的抗旱性直接評價方法。計算公式如下：

干旱脅迫強度(Drought intensity)DI= 1-Ymd/Ymw

(1)

抗旱系數(drought resistance coefficient)DRC=Yd/Yw

(2)

抗旱性指數(germplasm drought tolerance index)DTIg= (Yd/Yw)/ (Ymd/Ymw)

(3)

干旱傷害指數 (damage index)DDI= 1-Yd/Yw

(4)

干旱敏感指數 (sensitivity index)DSI= ( 1 -Yd/Yw) / (Ymd/Ymw)

(5)

抗旱指數(drought resistance index)DRI=Yd(Yd/Yw) /Ymd= (Yd/Yw) (Yd/Ymd)

(6)

抗旱指數值(DRI value)DRIv=Yd/Ymd×DRCj/DRCm=Yd/Ymd×(Yd/Yw÷Ymd/Ymw)=Yd2/Yw×Ymw/Ymd2

(7)

改進抗旱指數(improved drought resistance index)IDRI=Yd/Ymd×Yw/Ymw

(8)

耐旱指數 (Drought tolerance index)DTIv= (Yw/Ymw) (Yd/Ymd) (Ymd/Ymw) = (Yd×Yw) /Ymw2

(9)

以上公式中,Yd為旱處理測定值，Yw水處理測定值，Ymd為旱處理所有材料平均測定值，Ymw為所有材料平均水處理測定值，DRCj為某材料抗旱系數，DRCm為所有材料平均測定值抗旱系數。

1.7.2抗旱性綜合評價 以與抗旱性相關性較好的抗旱指標為基礎數據[2]，采用DPS軟件進行綜合評價。

(10)

(11)

公式(10)、(11)中，ri為抗旱系數、抗旱指數值分別與平均抗旱系數、平均抗旱指數值的相關系數。

1.7.3隸屬函數法、標準差系數賦予權重法 該方法采用各個指標抗旱系數DRC進行綜合評價[23]。首先按公式(12)對各個指標DRC標準化處理，求得相應隸屬函數值，然后用公式(13)計算各指標的標準差系數Vj，用公式(14)計算各指標的權重系數Wj，用公式(15)計算各材料綜合評價值D值，根據D值可對各材料抗旱性強弱進行排序，判斷抗旱能力的大小。公式(12)中，Xj表示第j個指標值，Xmin表示第j個指標的最小值，Xmax表示第j個指標的最大值。

(12)

(13)

(14)

(15)

1.8 抗旱性分類方法

參考路貴和[15]提出的抗旱性逐級分類法，將供試材料的抗旱性劃分為5種類型。

2 結果與分析

2.1 試驗干旱脅迫強度及水旱處理差異性檢驗

本試驗條件下苜蓿的地上生物量、株高的干旱脅迫強度為 0.67，地下生物量脅迫程度為0.71，分枝數為0.43。根冠比和根長脅迫強度最低(表2)。干旱脅迫強度(DI) 是評價一個試驗是否達到脅迫環境條件的指標，DI 的估計值范圍是 0～1, DI值越大, 說明干旱脅迫越嚴重?？梢杂肈I值來衡量不同試驗是否達到了脅迫條件。本試驗中，苜蓿地上生物量脅迫強度達到了0.67，因此達到了脅迫條件。地上生物量測定容易，以該指標作為脅迫強度衡量指標比地下生物量等指標更合適。

水旱處理6個鑒定指標測定值的變異系數都在0.15以上, 除根長和分枝數外其他性狀均以旱處理變異大于水處理。各個性狀經水旱處理間t檢驗，差異均達到極顯著水平，表明水、旱兩個處理之間存在顯著性差異，已符合抗旱鑒定試驗要求。

表2 水旱處理下不同鑒定指標統計分析Table 2 Statistical analysis of different identification indexes under water treatment and drought treatment

注：DT為旱處理，WT為水處理，**表示在0.01水平差異顯著，t0.01(175)=1.97

Note:DT indicate dry treat, WT indicate water treat,**indicate significant difference at the 0.01 level,t0.01(175)=1.97

2.2 不同鑒定指標測定值與平均抗旱系數、平均抗旱指數的相關性

為了確定苜蓿苗期地上生物量等鑒定指標的重要性，對這些鑒定指標與平均抗旱系數、平均抗旱指數進行了相關性分析(表3)。地上生物量等指標與平均抗旱系數相關性極顯著，除地下生物量外所有指標均與平均抗旱指數具有顯著相關性。與平均抗旱系數、平均抗旱指數的權重均以地上生物量較高，而根冠比為地上生物量與地下生物量計算所得，因此地上生物量和株高作為抗旱相對重要性更大，更有代表性，更適合作為鑒定指標。地上生物量測定相對較為容易。

表3 不同鑒定指標與平均抗旱系數ADC、平均抗旱指數ADI的相關性分析Table 3 The correlation analysis between different identification indexes and average drought resistance coefficient or index

注：**表示在0.01水平差異顯著

Note：** indicate significant difference at the 0.01 level

根據表3地上生物量相關性更強這一特點，采用本試驗苜蓿旱處理與水處理條件下地上生物量繪制了二維示意圖(圖 1)，在區分這批材料抗旱性表現方面，該圖較列表更直觀，其中 A、B、C 和 D 是以兩種條件下的供試材料平均產量為基準所劃分的四組區域。A 組包括在旱處理與水處理兩種條件下均高產的資源材料，B 組包括在旱處理條件下低產而水處理條件下高產的資源材料, C 組包括在旱處理條件下高產而水處理條件下低產的資源材料，D 組包括兩種條件下均低產的資源材料[1]。圖1中可以看出不同抗旱材料主要集中于哪個組，而且有助于篩選出具有某種特性的材料。A組最多，B組、C組、D組均較少。

圖1 供試苜蓿種質材料水旱處理地上生物量 二維示意圖Fig.1 Biplot for aboveground biomass of tested alfalfa germplasm under watered and dry treatment

2.3 不同抗旱評價指標與地上生物量的相關性分析

已知苜蓿地上生物量適宜作為抗旱性鑒定指標，因此采用水、旱處理地上生物量與不同評價指標進行了相關性分析(表4)?？购迪禂礑RC、抗旱性指數DTIg、傷害指數DDI、敏感指數DSI、抗旱指數

值DRIv、抗旱指數DRI、改進抗旱指數IDRI、耐旱指數DTIv均為以地上生物量為基礎的評價指標，加權抗旱系數WDC、加權抗旱指數WDI、綜合評價D值均為綜合評價指標。D值采用6個鑒定指標進行評價。

抗旱系數DRC和DTIg相關性為1；傷害指數DDI與敏感指數DSI相關性為1；由于抗旱系數DRC與DDI、DSI計算方法不同，相關性為-1，以上4個指標意義相同。抗旱指數DRI與 DRIv相關系數為1；改進抗旱指數IDRI與耐旱指數DTIv相關系數為1(表4)。這些相關性為1的指標是僅為計算公式有所不同，DTIg、DRIv、DTIv均分別在DRC、DRI、IDRI的計算公式基礎上引入脅迫強度。因此這些指標可簡化為3個指標DRC、DRI、IDRI，如果納入脅迫強度，則采用DTIg、DRIv、DTIv，減少了太多指標造成的評價方法混亂，更有利于有針對性選擇苜?？购敌栽u價指標。

2.4 苜蓿抗旱性評價方法的選擇

在進行苜?？购敌栽u價方法選擇時，要注意區分篩選目的，主要篩選目的有種質資源、水旱均高產抗旱品種、旱地條件高產品種篩選3大類。一是對苜蓿大量種質資源或創新材料的抗旱性鑒定評價，主要立足于抗旱性本身的表現，因為抗旱性強的材料不一定有較高的產量潛力(尤其是在正常水分條件下的產量潛力)，但這些強抗旱的材料在育種和抗旱性基礎研究中仍有很高的利用價值。二是抗旱品種評價方法的篩選是為了選育出抗旱品種，把育種目標放在選擇干旱脅迫條件下和正常水分條件下均能高產的品種上。三是旱地條件高產品種的篩選突出了旱地條件的生長表現。因此，需針對不同篩選目的，進一步闡釋各方法側重點。

表 4 抗旱評價指標與地上生物量相關性分析Table 4 The correlation analysis between drought resistance evaluation indexes and aboveground biomass

注：DT為旱處理，WT為水處理；**表示在0.01水平差異顯著

Note:DT indicate dry treat, WT indicate water treat; ** indicate significant difference at the 0.01 level

2.4.1種質資源抗旱性評價方法 從農藝學的角度講, 某材料抗旱就是指其水處理產量不一定很高，旱處理產量相對水處理來說降低不多，即抗旱性評價指標不必與水處理產量有顯著的相關關系[1]，無相關性的指標更適宜進行種質資源評價。而本試驗苜蓿WDC與水處理產量無相關性，D值、DRC與水處理產量相關系數較小(表4)，因此這3個指標最適宜作為種質資源自身抗旱性評價方法。DRC、DTIg、DDI、DSI與水旱處理產量相關系數相同(均為0.38、0.21)，而這些指標可簡化為一個指標，該結果與黎裕分析結果一致[1]。隸屬函數法D值和DRC與水處理相關系數相同(0.21)，適宜作為種質資源綜合評價方法，結果更為全面、科學，應用也較為廣泛。由于抗旱系數 DRC的簡捷性，在很多種質資源的鑒定評價試驗中，成為首選的抗旱性評價方法[4,15,24-29]。DRC反映了干旱脅迫降低產量的程度，消除了參試材料自身抗旱性差異，具有較強的科學性和合理性。不同試驗干旱程度不同，抗旱性指數DTIg納入了脅迫強度，更加符合不同試驗要求。抗旱性指數DTIg為抗旱系數DRC與脅迫強度DI的積，因此本試驗二者相關系數為1(表4)。

2.4.2水、旱均高產材料抗旱性評價 從育種角度講, 某材料抗旱就是指該材料在旱處理條件下的產量相對水處理條件下的產量來說降低不多，這個材料在旱處理和水處理條件下的產量均必須較高，抗旱性評價指標不但與旱處理，而且與水處理條件下的產量需要有顯著相關性，并且相關系數較高。本試驗苜蓿(表4)與水處理產量顯著相關性最強、相關系數最大的為改進抗旱指數IDRI和耐旱指數DTIv，因此這2個指標為遴選抗旱品種的最佳評價方法[1-2]。二者相關性系數為1，IDRI未納入脅迫強度，DTIv在IDRI的基礎上乘以了脅迫強度，更合乎人為劃定的評價標準。IDRI的計算公式顯示，旱處理與所有材料旱處理平均值的比值和水處理與所有材料水處理平均值的比值的乘積，反映了材料在旱處理和水處理條件下的產量表現，即當栽培條件發生變化時, 參試材料的產量隨之而變，抗旱性強的品種產量較高，在水、旱環境發生變化時仍具有表現產量較高的特點，穩定性強。

2.4.3旱地條件高產材料抗旱性評價 生產中氣候干旱和土壤干旱會對苜蓿的生長帶來明顯影響，在旱地條件下，高產的苜蓿材料更加重要。本試驗(表4)苜蓿與旱處理產量相關性最強，與水處理產量相關性弱的指標只有抗旱指數DRI和抗旱指數值DRIv。抗旱指數DRI從公式來看把旱地產量與抗旱系數結合起來，反映了參試材料旱處理下產量表現。黎裕指出，DRI在篩選品種和篩選種質資源時均不是最好的辦法，但是DRI把旱地產量和抗旱系數結合在一起，可能更適合強調旱處理條件下高產而不強調水處理條件下高產的情形，可以作為綜合抗旱性評價的方法[1]。同理，抗旱指數值DRIv在DRI基礎上脅迫強度考慮在內，更適宜在人為劃定的抗旱標準中應用，二者相關性系數為1。

綜上所述，通過該苜蓿抗旱評價試驗，對諸多評價方法比較結果表明，可概括為3個方法即DTIg、DTIv、DRIv(或DRC、IDRI、DRI)。

2.5 抗旱性分級方法

采用DTIg、DTIv、DRIv這3個方法進行抗旱性評價分類，分類均參考路貴和[7]的抗旱性逐級分類法, 將供試品種的抗旱性劃分為5種類型，每類包含的材料份數進行了說明(表5)。采用DRC、IDRI、DRI和DTIg、DTIv、DRIv評價結果不同級但別分類完全相同，只是劃分上下限范圍不同。隸屬函數值評價為綜合評價，也可以參考路貴和的抗旱性逐級分類法進行分級(表5)。

路貴和的分類法的優點是不論哪一批材料，均可以分為5類，但是只限于現有材料群體條件下，將現有群體內進行評價分類，同一類內不同材料可以按照抗旱性大小進行排序。但是如果沒有對照，這批材料可能都為極不抗旱類型或者均為極抗旱類型，如果有對照品種，不同試驗的數據結果才有一定可比性。分為5類的情況下，中等抗旱水平的材料總是最多的，大致是其他類別的2倍以上。通過抗旱系數、抗旱指數、隸屬函數法、等級評分法等方法可以根據數值大小進行總排序，但是缺乏分類。聚類分析可以進行分類，但為模糊分類法。方差分析采用字母標記法將各個材料平均數按由大到小排列，直到最小平均數被排列完；如果材料數過多，則字母標記法不能采用。采用抗旱系數、抗旱指數等其他方法則不受限制。

表5 不同抗旱評價指標分級標準的劃分Table 5 The grading standard of different drought resistance evaluation indexes

2.6 抗旱種質材料評價結果

對該批苜蓿材料采用DTIg進行種質資源抗旱性評價，采用DTIv進行抗旱品種篩選，采用DRIv進行旱地條件下高產品種的篩選。采用DTIg、DTIv、DRIv評價一級抗旱性材料分別為30、21、25份(表5)，其中DTIg有20個與DRIv結果相同，僅有3個與DTIv結果相同；3種方法抗旱性最強的材料也不一樣，更加說明明確篩選目的的重要性。敖漢苜蓿采用DTIv評價為四級(抗旱性弱)類型，DTIg、DRCv評價結果均為三級(抗旱性中等)類型。

3 討論與結論

3.1 干旱脅迫強度

干旱脅迫強度(DI)的估計值范圍是 0～1, DI值越大, 說明干旱脅迫越嚴重。黎裕田間試驗條件下的DI為0.1894[1]，本試驗地上生物量DI為0.67，脅迫強度更高。本試驗各鑒定指標的脅迫強度是不同的，脅迫強度較高而且容易測定的指標更適宜衡量脅迫程度，本試驗中地上生物量更為合適。不同試驗干旱脅迫程度不同，則不能對不同環境條件下的資源進行比較，因此可以考慮設置某個有代表性的品種作為通用對照[1]，增強不同試驗之間的可比性。小麥、玉米、大豆抗旱性鑒定評價標準中以抗旱系數 DRC劃分了5個抗旱類型的分級標準[4,17-19,25]，這容易導致不合適的評價結果，因為如果脅迫強度不一致，不同資源抗旱表現可能不同，如果試驗脅迫強度DI較小時，而試驗結果大批材料DRC較高的話，則會認定這些材料抗旱性均極強，顯然不合適，甚至違背事實本真[1]。除了設置通用對照外，把干旱脅迫強度納入評價方法中，效果也較好。Fischer 等[30]提出的抗旱性指數DTIg在DRC的基礎上在納入了干旱脅迫強度DI之后，基本符合了人為劃定的抗旱標準，結果更為尊重科學事實。

3.2 抗旱性鑒定指標的確定

大豆、水稻、苜蓿等不同植物抗旱性表現不同，在開展抗旱性鑒定評價時均需選擇該植物的適用指標，比較各性狀與水旱處理產量[2]或者受旱指數[16]的相關性，相關性越強，說明受旱影響越明顯，更適宜作為鑒定指標。本研究分析了地上生物量、地下生物量、株高、分枝數的抗旱系數(DRC)與平均DRC、抗旱指數值(DRIv)與平均DRIv的相關性，結果顯示這些指標與DRC和DRIv均具有顯著相關性，其中地上生物量和株高相關性最高，說明任何植物包括苜蓿適應逆境都是以降低產量為代價的。而且產量指標和形態學指標也是田間抗旱鑒定中的常用指標[31]，形態學指標采用最多最早,并且至今仍占重要地位,具有簡單、實用性強的特點[12,24]。

3.3 抗旱性評價方法的確定

不同的評價方法適宜不同的評價目的，本研究對11個評價方法進行了相關性分析，相關性為1的評價方法，實際是不同方法的變型，具有同一性，并不能為育種工作者提供更多的信息[32]。最經典的抗旱系數法適宜篩選苜蓿種質資源[2]，抗旱指數法適宜旱地條件下高產苜蓿資源的篩選，抗旱系數(DRC)和抗旱指數(DRI)在農作物小麥、玉米中均被廣泛應用[ 1,27,32]，DRC在苜?？购敌栽u價中叫法不一樣，稱為脅迫指數[24,33]，改進抗旱指數法(IDRI)在甘肅農科院大豆抗旱性研究應用中指出，同時考慮植物在逆境和正常條件下的產量表現, 可以篩選豐產、穩產的種質資源[2,34]。這3類抗旱性評價方法的確定，可有效的避免把產量和抗旱性兩套體系混在一起，可以根據需要，更加有針對性的選擇合適的抗旱性評價方法，在育種、科研方面具有非常重要的實踐意義。本文參試的苜蓿種質資源采用DTIg、DRIv、DTI v 3種評價方法進行抗旱性評價，結果顯示一級(抗旱性極強)材料數目分別為30份、25份、21份，對照敖漢苜蓿分別位居三級(抗旱性中等)、三級、四級(抗旱性弱)。

3.4 抗旱性分級方法

小麥、玉米、大豆地方標準抗旱性分級方法一般采用存活率、抗旱系數或抗旱指數分級[17-19]，但是苜蓿抗旱性強，存活率分級法不適用[11,24,33]，抗旱系數和抗旱指數分級可能存在不同試驗脅迫強度不同的缺點。聚類分析為模糊分類法，在樣本量較大時，要獲得聚類結論有一定困難, 由相似系數得出的不恰當的分析結果，聚類分析模型本身無法識別[35]。隸屬函數法只能人為取排在前列的作為抗旱性強的材料。方差分析的字母標記法限制了材料數量，不能系統分類。而路貴和的等級分類法恰巧能完成系統分類，該法可把任何一批但僅限同一批參試苜蓿劃分為5級[15]，同一級別內可以按照抗旱性強弱排序；為了增強不同試驗的可比性，需要設置有代表性的通用對照。劉寧也參考這一標準為黍稷抗旱性進行分級[36]。

3.5 抗旱性評價時期的確定

相對于發芽期、全生育期來說，苗期作為植物生長發育的開始階段對水分虧缺較為敏感，此時的水分脅迫不僅威脅幼苗的生存，對其后期的生長、生物量的形成以及順利越冬等都有一定影響[11]；田間全生育期鑒定評價，結果直觀、準確，可靠性強，但耗費的時間、人力和財力多，難以作眾多品種的鑒定[37]，僅有張俊麗開展了苜蓿全生育期抗旱評價[31]，還有3位學者利用田間現有苜蓿僅進行了生理指標分析[38-40]，無其他全生育期報導。苜蓿作為牧草利用的是全株營養體，所以苗期生物量指標進行抗旱性評價與全生育期生物量具有較強的相關性，評價結果可信度應該較強。