枯草芽孢桿菌Bs—15對柿樹炭疽病的離體防治效果

余賢美+侯長明+王潔+張坤鵬+艾呈祥

摘要：為探討枯草芽孢桿菌Bs-15對柿樹炭疽病的防治潛能，通過平板對峙試驗研究Bs-15對柿樹炭疽病菌的抑制作用，并通過離體接種試驗，研究Bs-15對柿樹炭疽病的防治效果。結果顯示，在對峙平板中形成穩定而明顯的抑菌帶，寬為（0.56±0.05）cm；離體接種試驗中，先接種Bs-15菌懸液后接種菌餅處理比先接種菌餅再接種Bs-15菌懸液處理對柿樹炭疽病的防治效果好，其抑制率分別為54.76%和47.62%，防治效果分別為78.54%和70.04%，說明枯草芽孢桿菌Bs-15可能通過產生誘導抗性提高防效。本試驗結果表明，枯草芽孢桿菌Bs-15對柿樹炭疽病有較好的防治效果，可作為潛在的生防菌株，為柿樹炭疽病的防治提供新的途徑和方法。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；柿樹炭疽病；哈銳炭疽菌；平板對峙試驗；離體接種試驗

中圖分類號：S436.65 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2017）07-0125-03

Abstract To investigate the control potential of Bacillus subtilis Bs-15 on persimmon anthracnose， the inhibition of Bs-15 to Colletotrichum horri was studied via dual-culture test， and the control effect of Bs-15 on persimmon anthracnose was studied via in vitro inoculation experiment. The results showed that the inhibition zone in dual-cultured plate was （0.56±0.05）cm. The in vitro inoculation experiment showed that the control effect of spraying the bacterium suspension of Bs-15 before inoculating the pathogenic disk was better than that of spraying the bacterium suspension of Bs-15 after inoculating the pathogenic disk with the inhibition ratio of 54.76% and 47.62% and the control efficiency of 78.54% and 70.04%， respectively. It indicated that Bs-15 might have better control efficiency by producing the induced resistance. The results indicated that because of good effect on persimmon anthracnose， Bs-15 could be used as a potential biocontrol bacterial strain and provide a new path and method for control of persimmon anthracnose.

Keywords Bacillus subtilis； Persimmon anthracnose； Colletotrichum horri； Dual-culture test； In vitro inoculation experiment

柿樹炭疽病是危害柿樹的一種毀滅性病害，嚴重時可造成巨大的經濟損失，已成為阻礙柿樹產業發展的重要因素[1，2]。對于柿樹炭疽病的防治，在加強栽培管理措施的基礎上，仍以化學防治為主要手段，而多年連續使用，已使病原菌產生抗藥性，同時還造成農藥殘留、環境污染等問題，甚至危害人類健康[3-5]。

生物防治是一種環境友好型的防治方法，具有廣泛的應用價值，已成為病害防治的熱點。芽孢桿菌是目前生防細菌中被研究較多的一類，尤其是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。枯草芽孢桿菌是一類重要的生防菌，對多種植物病原真菌具有抑制作用，對茄子立枯病、甜椒枯萎病、大豆根腐病、橡膠炭疽病、桑椹腐爛病、棉花黃萎病、玉米紋枯病、梨褐腐病、水稻稻瘟病、葡萄霜霉病等病害，均具有較好的防治效果[6-10]，說明枯草芽孢桿菌在生物防治方面具有廣泛的應用前景。本課題組分離鑒定的枯草芽孢桿菌Bs-15對甜椒枯萎病菌的抑制率達93.15%，防效達56.94%[11，12]，在生物防治方面具有一定潛能。

本課題通過室內平板對峙試驗和離體接種試驗，研究枯草芽孢桿菌Bs-15對柿樹炭疽病菌的抑制作用和對柿樹炭疽病的防治效果，以探討該菌株在柿樹炭疽病防治方面的應用潛能，為柿樹炭疽病的防治提供可行的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌Bs-15為本課題組分離保存；柿樹炭疽病菌哈銳炭疽菌Colletotrichum horri分離自山東省果樹研究所萬吉山試驗基地柿子園三年生牛心柿樹[13]；離體接種所用柿樹葉片采自山東省果樹研究所萬吉山試驗基地柿子園三年生健康牛心柿樹。

1.2 平板對峙試驗

1.2.1 接種菌液的制備 將Bs-15接種到LB液體培養基中，于37℃振蕩培養過夜，備用。

1.2.2 菌餅的制備 將柿樹炭疽病菌接種于PDA培養基平板中，28℃恒溫培養5天，用打孔器從菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅，備用。

1.2.3 室內平板對峙試驗 按5點接種法進行接種。將病原菌菌餅接種于PDA培養基平板中央，在菌餅四周用接種針對稱等距離點接Bs-15菌液，重復3次。于28℃條件下培養7～10天，觀察兩種菌的生長情況及抑菌帶，待形成穩定的抑菌帶后測量其寬度并求平均值。

1.3 室內離體接種試驗

1.3.1 菌懸液的制備 將Bs-15接種到LB液體培養基中，于37℃振蕩培養過夜，用10 mmol/L無菌硫酸鎂溶液制備成菌懸液，使菌體數約為106～107 cfu/mL。

1.3.2 菌餅的制備 離體接種所需菌餅的制備，同1.2.2。

1.3.3 離體接種 取柿子葉片，用無菌大頭針刺傷形成傷口，采用以下2種方式進行接種：①先噴Bs-15菌懸液，兩天后再于傷口處接種柿樹炭疽病菌菌餅；②于傷口處先接種柿樹炭疽病菌菌餅，兩天后再噴Bs-15菌懸液。每處理接種30片葉片，以接種菌餅+噴無菌硫酸鎂溶液為對照，重復3次。于28℃條件下保濕培養，觀察病斑的形成，于第7天統計發病率。按照鄧維萍等[14]的方法測定病斑面積S，不發病記為0級（-）；1級（+）：S≤1 cm2；2級（++）：1 cm24 cm2，并統計各處理不同病級的葉片數。

根據以下公式計算抑制率、病情指數及防治效果。

抑制率（%）=（對照發病率-處理發病率）/對照發病率×100 ；

病情指數=Σ（各級病葉數×相應病級）/（葉片總數×最高病級）×100 ；

防治效果（%）=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100 。

2 結果與分析

2.1 Bs-15對柿樹炭疽病菌的拮抗作用

接種平板，于28℃條件下培養7天后，形成了穩定而明顯的抑菌帶，帶寬為（0.56±0.05）cm（圖1）。說明枯草芽孢桿菌Bs-15對柿樹炭疽病菌有較強的拮抗作用。

2.2 Bs-15對柿樹炭疽病的離體防效

表1可見，對照發病葉片的病級主要集中在3級，其次是2級，部分葉片病級為4級和5級；2個處理發病葉片的病級主要集中在1級，其次是2級，無4級和5級病葉。表2可見，Bs-15極顯著降低了柿樹炭疽病的發病率和病情指數；菌懸液噴施時間對防治效果有顯著影響，先噴施Bs-15菌懸液再接種炭疽病菌菌餅的效果明顯高于先接種炭疽病菌菌餅再噴施Bs-15菌懸液，前者抑制率為54.76%，防治效果為78.54%，后者抑制率為47.62%，防治效果為70.04%。

3 討論與結論

為探討枯草芽孢桿菌Bs-15對柿樹炭疽病的防治效果，本課題通過室內平板對峙試驗研究了枯草芽孢桿菌Bs-15對柿樹炭疽病菌的拮抗作用，結果顯示，Bs-15對柿樹炭疽病菌具有較好的拮抗作用，在對峙平板上形成了穩定而明顯的抑菌帶，帶寬為（0.56±0.05）cm。然后通過離體接種試驗研究了Bs-15對柿樹炭疽病的防效，發現對照發病葉片的病級主要集中在3、2級，而接種處理發病葉片主要集中在1、2級，該結果與筆者之前的接種結果[13]相一致；菌株Bs-15顯著降低了柿樹炭疽病的發病率和病情指數，而且菌懸液的噴施時間對防治效果有顯著影響，先噴菌懸液再接菌餅效果明顯高于先接菌餅再噴菌懸液，說明，Bs-15有可能通過產生誘導抗性提高防治效果[15]。但是，由于本試驗采用室內離體接種的方法進行，其環境相對穩定，影響因子單一，防治效果相對較高，而對于在環境相對復雜的盆栽試驗或田間試驗，該菌株對柿樹炭疽病的防治效果有待于進一步研究。

參 考 文 獻：

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