基于AFLP標記的黃河三角洲中國檉柳種質資源遺傳多樣性分析

李永濤+楊慶山+劉德璽+周健+王莉莉+王振猛+魏文千

摘要：為了解黃河三角洲地區分布的中國檉柳單株間的遺傳關系，利用AFLP 分子標記技術對黃河三角洲濱海地區天然分布的60個中國檉柳優良單株的遺傳多樣性進行了分析。結果表明，篩選出的8對引物組合在60個中國檉柳單株中共擴增出1 197個條帶，其中多態性條帶1 177個，平均每對引物擴增出149.63個條帶和147.13個多態性條帶，平均多態性條帶比率為98.27%。每個位點的平均多態信息量為0.1648，平均有效等位基因數為1.2562，平均多樣性指數為0.2718。60份材料間的遺傳相似性系數介于0.8148～0.9172之間，經聚類分析，以遺傳相似性系數0.86為閾值，可將60份種質資源聚為6個類群；其中，第6組群內再以遺傳相似性系數0.872為閾值時，又可分為7個亞組。本研究揭示出黃河三角洲濱海地區中國檉柳單株間雖存在一定的遺傳多樣性，但遺傳基礎差異較小，可為該區域檉柳種質資源保存、鑒定和利用提供理論依據。

關鍵詞：黃河三角洲；中國檉柳；AFLP；遺傳多樣性

中圖分類號：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2017）07-0021-06

Abstract In order to understand the genetic relationship of Tamarix chinensis in the Yellow River Delta， the genetic diversity of 60 T. chinensis superior individuals was tested by AFLP technique. The results showed that 1 197 fragments were amplified by 8 selective primer pairs from 60 superior individuals of T. chinensis， and there were 1 177 polymorphic fragments. A total of 149.63 fragments and 147.13 polymorphic fragments were amplified for each pair of primers. The average polymorphism percentage was 98.27%. The average polymorphic information of each locus was 0.1648， the average number of effective alleles was 1.2562， and the average index of genetic diversity was 0.2718. The average genetic similarity coefficients ranged from 0.8148 to 0.9172. Through clustering analysis， the 60 samples were clustered into 6 groups when the genetic similarity coefficient of 0.86 was used as the threshold value. In which， when the genetic similarity coefficient was 0.872， the sixth group could be divided into 7 subgroups. In short， although there were certain genetic diversity among T. chinensis superior individuals in the Yellow River Delta， the genetic basis difference was narrow. The results could provide theoretical bases for germplasm conservation， identification and utilization of T. chinesis in this region.

Keywords The Yellow River Delta； Tamarix chinensis； AFLP； Genetic diversity

黃河三角洲濱海地區是中國北方典型的泥質海岸，地下水埋藏淺且礦化度高，海水易內侵，土壤鹽漬化嚴重，生態系統脆弱。目前，分布于黃河三角洲沿海及灘涂地帶的大面積檉柳群落是維持該地區生態環境的重要支柱，其在黃河三角洲的生態維護以及植物資源的種質保護上都具有極其重要的價值[1]。

檉柳（Tamarix chinensis）為檉柳科（Tamaricaceae）檉柳屬（Tamarix Linn.）植物，又稱中國檉柳、三春柳等，具有高抗鹽、抗旱、耐水濕的生物學特性[2]。黃河三角洲地區目前有中國檉柳和甘蒙檉柳兩種檉柳分布，甘蒙檉柳多為大面積分布，中國檉柳多為零星散生。與甘蒙檉柳相比，中國檉柳植株更為高大，綠化效果更佳。目前中國檉柳已成為黃河三角洲濱海重鹽堿地區重要的生態修復物種，并在鹽堿地綠化和植被修復中得到廣泛應用[3]。國內外對檉柳屬植物的研究較多，內容涉及遺傳分類、資源分布、抗逆生理等各個方面[4-6]。近幾年，研究者們對于將分子標記應用于檉柳種質資源研究進行了有益的探索。趙景奎等[7]利用RAPD分子標記技術，對分布于東營市內不同小區域檉柳天然群體的遺傳多樣性進行檢測。蔣志敏等[8]利用ISSR分子標記，對來自黃河三角洲三個居群的90個檉柳個體的遺傳多樣性進行了對比分析，并深入探討了居群結構和遺傳分化格局的成因。葉春秀等[9]選用SSR分子標記技術對10份分布于新疆塔河流域上、中、下游的檉柳種質資源進行遺傳多樣性分析，并構建了每份種質的指紋圖譜。目前，利用RAPD、SSR分子標記技術對檉柳天然群體進行遺傳多樣性的研究已有所報道，但利用AFLP技術分析中國檉柳的遺傳多樣性還未見相關報道。為深入了解黃河三角洲濱海地區中國檉柳的遺傳結構，本研究以天然分布的60份中國檉柳優良單株為研究材料，利用AFLP分子標記對其進行遺傳多樣性分析，以期為黃河三角洲濱海地區檉柳種質資源的保存、鑒定和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為黃河三角洲濱海區域天然分布的中國檉柳優良喬化型單株60株，采集時分別標記其經緯度（表1）。群體間為避免采集到同一家系的個體，各采集單株至少相隔1 km。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 剪取每個單株當年新生鮮葉片，立即放入裝有硅膠的密封袋中干燥保存，帶回實驗室置于-70℃冰箱保存備用。采用CTAB 法提取葉片總DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，-20℃保存備用。

1.2.2 AFLP擴增及檢測 從64對隨機引物組合中篩選出擴增條帶數量多、多態性好、清晰度高、分布均勻的8 對引物組合（表2）。采用PstⅠ和MseⅠ內切酶對DNA樣品進行酶切，然后與PstⅠ和MseⅠ特定接頭連接，通過PstⅠ和MseⅠ預擴增引物進行預擴增。預擴增體系為：酶切連接產物2 μL，PstⅠ和MseⅠ預擴增引物各0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 18.5 μL，共計25 μL體系；預擴增PCR條件為：94℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 80 s，循環30次；再72℃延伸5 min，反應終止于4℃。將預擴增產物稀釋20倍后，采用PstⅠ和MseⅠ引物組合進行選擇性擴增，擴增體系為：預擴稀釋樣品2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，PstⅠ引物1 μL，MseⅠ引物1 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 17.5 μL，共計25 μL體系；選擇性擴增條件為：94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 80 s，1個循環；然后以每循環復性溫度逐級降低0.7℃的梯度繼續12個循環；接著按94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 80 s，擴增23輪；最后再72℃延伸5 min，反應終止于4℃。

PCR擴增在Gene Amp PCR System 9600擴增儀上完成，內切酶和T4連接酶均購自New England Biolabs公司，接頭及引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。擴增產物變性后在4%聚丙烯酰胺變性凝膠上電泳分離，染色顯影。

1.3 數據處理與分析

在電泳圖譜上對遷移率相同的條帶進行統計，有帶記為1，無帶記為0。采用POPGENE version 1.32軟件計算多態性條帶比率（PPB）、多態信息量（PIC）、有效等位基因數（Ne）、多態性信息指數（PIC） 和多樣性指數（I）等遺傳多樣性指標；利用NTSYSpc-V.2.1計算遺傳相似性系數；根據相似性系數進行UPGMA聚類分析[10]。

2 結果與分析

2.1 AFLP 擴增結果

利用篩選出的8對多態性較高的引物組合對60份中國檉柳材料進行AFLP擴增，圖譜（圖1）顯示擴增多態性好，所得擴增產物條帶清晰，易于分辨。其中，擴增位點數最多的是引物P-GAG/ M-CTG組合，最少的是引物P-GAG/M-CTT組合（表3）。擴增片段大小主要在70～500 bp之間，8對引物在60份材料中共獲得1 197個條帶，其中多態性條帶1 177個；不同引物對擴增的多態帶比例均較高，變化范圍為96.00%～99.43%，差異較小；其中引物對P-GAG/M-CTG擴增的多態帶比例最高，為99.43%，而P-GTG/M-CTG擴增的多態帶比例最低，為96.00%，平均多態性條帶比率為98.27%。每個位點的平均多態信息量為0.1648，平均有效等位基因數為1.2562，平均多樣性指數為0.2718。由此可見，選取的引物在檉柳優良單株間表現出較高的多態性水平，說明AFLP標記適合進行檉柳遺傳多樣性統計分析。

2.2 遺傳相似性分析

遺傳相似性系數是表示不同個體之間遺傳差異大小的重要指標，60個中國檉柳單株的遺傳相似性系數，在0.8148～0.9172之間，平均為0.8437。遺傳相似性系數最小的是DY-18和XS-6，為0.8148，說明二者的親緣關系最遠，差異性最大；遺傳相似性系數最大的是XS-29和XS-30，達到0.9172，說明二者的親緣關系最近，遺傳差異性最小。總之，通過遺傳相似性分析，60個中國檉柳單株間均呈現出較近的親緣關系，這可能與材料地域性有重要關系。

2.3 聚類分析

基于遺傳相似性系數，通過UPGMA 法對60個中國檉柳單株進行聚類分析。由圖2可以直觀地看出不同單株間的遺傳關系，在以相似性系數0.86為閾值進行切割時，60個檉柳單株可劃分為6組。第1組包括2個單株，分別為XS-6和XS-7；第2組包括XS-10、XS-11、XS-14、XS-17、XS-23共5個單株；第3組包括1個單株為XS-31；第4組包括2個單株，分別為XS-5和XS-22；第5組包括1個單株為XS-15；第6組包括49個單株。在以遺傳相似性系數0.872為閾值進行切割時，還可將第6組分為7個亞組，其中第1亞組包括XS-18、XS-21共2個單株；第2亞組、第3亞組和第4亞組均各包含1個單株，分別為XS-32、DY-26和 DY-22；第5亞組包括DY-1～DY-21、DY-23～DY-25、XC-35～XC-38共28個單株；第6亞組包括XS-4、XS-8、XS-12、XS-13、XS-16、XS-19、XS-20 和XS-24～XS-30共14個單株；第7亞組包括XS-3、XS-9共2個單株。聚類結果表明，大部分種質親緣關系較近，遺傳組成相似，種質間存在較多的基因交流。對應聚類分析結果和材料分布位置，60個檉柳單株的分組與其分布位置不完全一致。

3 討論與結論

遺傳多樣性是物種基因豐富度的直接反映，而分子標記技術可快速檢測遺傳變異水平的高低。研究表明，AFLP是研究遺傳多樣性非常有效的分子標記技術[11]。本研究利用AFLP技術分析了60個中國檉柳單株，檢測出大量的多態性位點，每對引物組合在不同的材料間也檢測出共同的位點，表明AFLP 分子標記可用于中國檉柳單株的鑒定。Vogel等[12]認為當今世界上四大標記系統的綜合效用大小比較關系為AFLP>SSR>RAPD>RFLP。趙景奎等[7]采用隨機擴增多態DNA （RAPD）分子標記技術分析了黃河三角洲檉柳3個天然群體的遺傳多樣性，多態譜帶比率為40.07%。葉春秀等[9]選用SSR分子標記技術對新疆塔河流域的檉柳種質資源進行遺傳多樣性分析，得出多態性比率為79.49%。本研究采用8對AFLP引物即可以將60份檉柳種質資源區分開來，供試的60個中國檉柳單株的多態性條帶百分率平均值達到了98.27%，表明AFLP標記在植物種質鑒定和遺傳多樣性分析中具有重要意義，這與Vogel等[12]的研究完全一致。

通常情況下，AFLP電泳圖譜上的每一條擴增條帶都對應1個基因位點，出現多態性條帶也就意味著某個或某些物種在該位點上存在變異[13，14]，如果多態性條帶百分率超過50%，就可以認為該物種有較為豐富的遺傳多樣性[15]。而本研究中平均多態性條帶比率達到了98.27%，表明該區域檉柳具有較高的遺傳多樣性。根據AFLP 標記及聚類分析結果，60個中國檉柳單株間的遺傳相似性系數在0.8148～0.9172之間，平均為0.8437。其中，遺傳相似性系數最高的是XS-29 和XS-30。通過地理坐標分析，兩者直線距離為1.16 km，距離最近，說明地理距離一定程度上決定了種質間的遺傳相似性；但聚類分析將檉柳種質分成的6組中，其中部分地理距離較近的單株并未嚴格地聚在一組，說明基于AFLP分子標記獲得的60個中國檉柳單株間的遺傳關系與其地理距離沒有嚴格的相關性。

檉柳是黃河三角洲非常典型的適生植被，對土壤含鹽量和土壤水分的忍耐能力直接決定其適應生境的能力。而適宜的生境使檉柳遭受的環境選擇壓力較小，保留了較大的群體數量。同時隔離障礙少，有利于基因流動，豐富了各群體內的基因資源[16]。本研究中60個檉柳單株間親緣關系較近，遺傳差異較小，可能個體彼此之間有許多相互連接的鄰里，由于基因頻率在鄰里間進行交流，鄰里間的基因頻率差異小，導致各單株間在地理位置和遺傳距離之間有一定關系。需要指出的是，本研究對檉柳種質資源的取材不夠全面，所有取材集中于黃河三角洲濱海區域，范圍小，不利于全面綜合分析檉柳的遺傳多樣性，今后有待于擴大取材范圍進行更深入的研究。

參 考 文 獻：

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