PCR檢測對蝦白斑綜合征病毒的組織特異性

張燕飛+簡賀君+謝俊剛

摘 要：該研究提取了95%酒精保存的病蝦組織（鰓、肌肉、表皮、附肢和復眼）的基因組總DNA，并進行了對蝦白斑綜合征病毒的PCR檢測。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，病蝦組織（鰓、肌肉、表皮、附肢和復眼）有輕微的跑帶現象，鰓和肌肉比表皮、附肢和復眼的基因組總DNA電泳條帶亮。PCR檢測結果發現，對蝦不同組織的陽性檢出率高低順序如下：鰓>肌肉=表皮>附肢>復眼。研究結果說明，鰓和肌肉可作為對蝦白斑綜合征病毒PCR檢測的合適部位。

關鍵詞：對蝦白斑綜合征病毒；PCR；組織特異性

中圖分類號 S945 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）13-0132-02

對蝦白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV），屬線頭病毒科（Nimaviridae）白斑病毒屬（Whispovirus）。該病毒曾被誤以為桿狀病毒，曾被稱為皮下及造血壞死桿狀病毒等[1]。對蝦白斑綜合病毒可以引起對蝦嚴重的傳染病-白斑綜合征（俗稱白斑?。?，20世紀90年代以來一直嚴重威脅著全世界對蝦的養殖安全。該病毒誘發疾病的特點是發病急、發病率高、死亡速度快。病蝦停止攝食，部分瀕死蝦甲殼出現白色斑點，白斑綜合征因此得名。世界動物衛生組織（OIE）將其列為強制通報疫病，我國將其列為一類動物疫病[1]。近年來，隨著養殖環境的惡化，對蝦病毒性疾病頻繁暴發，嚴重影響了對蝦養殖業的健康發展。

對蝦養殖是廣東省沿海地區的一個重要產業，由于WSSV致病性強、危害性大、流行范圍廣，建立特異、敏感、快速的檢測系統極為重要。WSSV檢測方法有多種，如現場快速診斷、常規組織學、電鏡、免疫學、PCR和原位雜交等。PCR具有特異性和敏感性都很高的特點，是檢測WSSV的重要手段。因此，本文對PCR檢測對蝦白斑綜合征病毒的組織特異性進行分析，為實現對蝦養殖中對白斑綜合征病毒的監控打下基礎。

1 材料與方法

1.1 病料 病蝦取自廣東省江門市對蝦養殖場，病蝦為疑似白斑綜合癥、瀕死的南美白對蝦，用95%乙醇保存，運回實驗室用于檢測。

1.2 試劑和引物 Tissue DNA Kit D3396購自美國OMEGA公司；Easy PureTM Quick Gel Extraction Kit和Easy PureTM Plasmid MiniPrep Kit購自北京全式金生物技術有限公司；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、10×buffer、氯化鎂（25mmol/L）和電泳樣品緩沖液均購自TaKaRa公司；引物由上海生物工程有限公司合成（表1）。

1.4 基因組總DNA的檢測 將6μL基因組總DNA和2μL電泳樣品緩沖液混勻后，加入凝膠孔中，5V/cm電泳約30min，用凝膠成像儀拍照并判斷結果。

1.5 PCR鑒定 PCR反應總體積為100μL，其中含10×buffer 10μL、dNTP 2μL、氯化鎂10μL、引物F1和R1各2.5μL、滅菌雙蒸水62μL和待測樣品10μL。將以上反應混合液混勻后稍離心，設置反應條件為：94℃預變性4min，然后94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，30個循環；72℃延伸10min，最后4℃保溫。同時設立陽性、陰性和空白對照。取反應產物5μL于含有溴化乙錠的0.8%瓊脂糖凝膠。第一次PCR后，如結果為陽性，根據陽性的強弱作10～1000稀釋，如結果為陰性，則不作稀釋，取10μL作為第二次PCR反應的模板。同時設立陽性、陰性和空白對照。按照1.6分別加入反應組分及引物F2和R2各2.5μL，進行第二次PCR。

1.6 瓊脂糖電泳 將6μL樣品和2μL電泳樣品緩沖液混勻后，加入凝膠孔中，5V/cm電泳15～30min，用凝膠成像儀拍照并判斷結果。第一次PCR擴增，陽性對照會得到一條大小1447bp的DNA片段，陰性和空白對照沒有該核酸條帶，第二次PCR后，陽性對照會得到一條大小941bp的DNA片段，陰性和空白對照沒有該核酸條帶。待測樣品2次PCR均能得到和陽性對照同樣大小的DNA片段，送上海生物工程有限公司測序，并與NCBI上的對蝦白斑病毒序列進行比對，序列相似性在98%以上判為陽性；若兩次PCR均無目的帶或測序不對者判為陰性。

2 結果與分析

2.1 基因組總DNA的檢測結果 為了檢測組織提取的基因組總DNA降解情況，將提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示鰓、肌肉、表皮、附肢和復眼都有輕微的跑帶現象，鰓和肌肉比表皮、附肢和復眼的基因組總DNA條帶亮。

2.2 PCR檢測結果 應用上述方法對50尾病蝦的不同組織進行PCR檢測，凝膠電泳和測序結果顯示，鰓的陽性檢出率為98%；肌肉和表皮的陽性檢出率均為90%；附肢的陽性檢出率為76%；復眼的陽性檢出率為70%（表2）。

3 討論

用凝膠電泳對不同組織提取的基因組總DNA質量進行檢測，結果發現鰓、肌肉、表皮、附肢和復眼都有輕微的跑帶現象，鰓和肌肉比表皮、附肢和復眼的基因組總DNA條帶亮。試驗中存在跑帶現象，這說明用95%乙醇保存的樣品基因組總DNA有輕微降解。用液氮保存樣品，基因組總DNA降解最少。然而，大容積液氮罐在野外取樣中攜帶不便，存在氣體外泄、人員凍傷等隱患，小容積液氮罐氣體容易揮發，保持時間短。因此液氮凍存不適用于長途野外樣品采集工作。95%乙醇溶液配制簡單，攜帶方便，是較佳的野外取樣保存方法。

本次研究中發現，對蝦不同組織的陽性檢出率高低順序如下：鰓>肌肉=表皮>附肢>復眼。有研究指出WSSV先感染宿主血細胞，再通過血液循環將病毒粒子傳播到宿主體內的其他組織[2]。WSSV感染的細胞主要分布在外胚層和中胚層起源的組織，如鰓、表皮、肌肉、前腸、后腸、胃、性腺、淋巴組織、心臟、觸角腺以及神經系統的相關細胞等。由于甲殼動物特殊的攝食和呼吸方式，水中的病毒粒子可以經鰓部感染宿主，而鰓也被公認是WSSV感染較嚴重的部位。在本次研究中，復眼的陽性檢出率最低。Lo等[3]對帶復眼的眼柄進行PCR檢測，結果為陰性，只有去除復眼的眼柄才為陽性，因此他推測對蝦的復眼可能含有某種抑制劑，導致結果出現假陰性。

通過本研究，建議在野外可用95%乙醇保存對蝦白斑綜合征病料樣品，鰓和肌肉可作為WSSV PCR檢測的合適部位。

參考文獻

[1]陳愛平，江育林，錢冬，等.白斑綜合征[J].中國水產，2010（10）：64-65.

[2]Di Leonardo V A，Bonnichon V，Roch P，et al.Comparative WSSV infection routes in the shrimp genera Marsupenaeus and Palaemon[J].Journal of Fish Diseases，2005，28（9）：565-569.

[3]Lo C F，Leu J H，Ho C H，et al.Detection of baculovirus associated with white spot syndrome（WSBV）in penaeid shrimps using polymerase chain reaction[J].Diseases of Aquatic Organism，1996，25：133-141. （責編：張宏民）