冰燈玉露松散型胚性愈傷組織的誘導方法

嚴小峰+劉艷軍+黃俊軒+楊靜慧+李建科+武春霞

摘 要：為了獲得冰燈玉露松散型胚性愈傷組織，采用冰燈玉露組培苗葉片為外植體，在含有不同激素的培養(yǎng)基上，通過不同的繼代培養(yǎng)，從中找到誘導出松散型胚性愈傷組織的最適條件。結果顯示，在1/2 MS+2 mg·L-1 2，4-D+20 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上可以誘導出松軟的愈傷組織。再將這些松軟的愈傷組織轉接到MS+1 mg·L-1 BA+0.5 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上，經(jīng)過3～5次繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)時選擇質地較硬、結構松散的愈傷組織進行轉移，最終獲得結構松散的愈傷組織。再將這些松散型愈傷組織在MS+2 mg·L-1 BA+0.5 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過2～3次繼代培養(yǎng)即可獲得冰燈玉露松散型胚性愈傷組織。該試驗結果可為冰燈玉露離體誘變育種及其相關的科學研究提供良好的試材。

關鍵詞：冰燈玉露；松散型胚性愈傷組織；繼代培養(yǎng)；培養(yǎng)基

中圖分類號：S382.36 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.07.006

Induction Method of Loose Embryogenic Callus of Haworthia cooperivar

YAN Xiaofeng，LIU Yanjun，HUANG Junxuan，YANG Jinghui，LI Jianke，WU Chunxia

（College of Horticulture and Landscape Architecture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract： In order to obtain the loose embryogenic callus of Haworthia cooperivar， the optimal conditions for the induction of loosely embryogenic callus were found by using the leaf explants of tissue culture plantlet in the medium containing different hormones and through different subculture. The results showed that soft callus could be induced on 1/2 MS+2 mg·L-1 2，4-D+20 g·L-1 sucrose medium. The callus was transferred to MS+1 mg·L-1 BA+0.5 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1 sucrose medium， and the callus was transferred after 3 to 5 times of subculture， and the loose callus was obtained after subculture. These calluses were cultured on the medium of MS+2 mg·L-1 BA+0.5 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1 sucrose， and the loose embryogenic callus of Haworthia cooperivar was obtained through 2～3 subculture. The results of this study provide good experimental materials for the mutagenic breeding of Haworthia cooperivar and its related scientific research.

Key words： Haworthia cooperivar； loosely embryogenic callus； subculture； medium

冰燈玉露（Haworthia cooperivar）屬于百合科十二卷屬的多年生肉質草本植物，具有很高的觀賞價值。近年來，多肉植物越來越受到廣大花卉愛好者的青睞。一些花卉栽培者廣泛收集各種玉露品種，并通過雜交育種手段培育出各式各樣的新品種，以滿足市場的需求[1-3]。常規(guī)育種由于受到種質資源的限制，一些新的性狀很難通過雜交的方法獲得。誘變育種是一種簡便易行且能夠獲得許多新鮮性狀的育種手段。在誘變育種中，采用體細胞離體誘變技術是目前較為流行的育種新方法，在許多植物上已獲得應用。在離體誘變育種中，最有優(yōu)勢的材料是胚性愈傷組織，因此，獲得胚性愈傷組織是進行體細胞誘變育種的關鍵[4-8]。

多肉植物的再生一般通過原球莖的途徑進行，在適當激素的作用下，在外植體的傷口部位會形成球形結構的愈傷組織。這些組織一般為淡綠色、結構緊密的愈傷組織類型，這種球形愈傷組織在沒有激素或少量分裂素的培養(yǎng)基上可以形成不定芽，對這些不定芽繼續(xù)培養(yǎng)就可以獲得再生植株，從而建立完整的離體再生體系[9-15]。但采用胚性愈傷組織再生一般不容易實現(xiàn)，其主要原因是形成的愈傷組織一般結構都很緊密，極易通過器官發(fā)生的途徑形成原球莖。為此，本試驗的目的就是誘導冰燈玉露產(chǎn)生胚性愈傷組織，通過胚狀體發(fā)生的途徑進行離體再生。本試驗的結果可以為冰燈玉露離體誘變育種及其相關的科學研究提供良好的試材。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗中所用冰燈玉露組培苗來源于天津農學院園林植物實驗室。

1.2 方 法

1.2.1 松軟性愈傷組織的誘導 將冰燈玉露組培苗在超凈臺中將葉片剪下，注意不要將葉片的尖端造成傷口，僅留葉柄一段有傷口。將葉片接種到事先配制好的含有不同激素和不同滲透壓的MS培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)，主要目的是誘導葉片傷口部位產(chǎn)生松軟型愈傷組織。培養(yǎng)條件為25 ℃、1 000 lx光照強度下連續(xù)光照。試驗所用容器為100 mL三角瓶，內裝30 mL培養(yǎng)基。每個三角瓶中接種5塊葉片，每個處理做8個瓶重復。接種上葉片后，每天對其進行觀察，經(jīng)過30 d培養(yǎng)，對愈傷組織誘導情況進行記錄與統(tǒng)計，找到適宜的培養(yǎng)基配方。

1.2.2 松散型愈傷組織的誘導 將上一步驟中誘導出的冰燈玉露松軟型愈傷組織，轉移到事先配制好的含有不同激素的MS培養(yǎng)基上，目的是進行松散型愈傷組織的誘導。試驗在每個三角瓶中接種10塊愈傷組織，每個處理做5個瓶重復。培養(yǎng)條件為22 ℃、2 000 lx光照強度下連續(xù)光照。培養(yǎng)14 d為一次繼代時間，繼代時選擇結構松散、質地較硬的愈傷組織進行選擇性轉移，同時將稀軟、褐變的愈傷組織淘汰。經(jīng)過3次繼代培養(yǎng)，對愈傷組織誘導情況進行記錄與統(tǒng)計，找到誘導松散型愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方。

1.2.3 松散型胚性愈傷組織的誘導 經(jīng)過松散型愈傷組織的誘導，將結構松散、質地較硬的愈傷組織作為外植體，轉接到新的培養(yǎng)基上進行松散型胚性愈傷組織的誘導。培養(yǎng)基中加入不同濃度的激素配比，試驗設計與上一步驟相同。培養(yǎng)條件為23 ℃、3 000 lx光照強度下連續(xù)光照。培養(yǎng)20 d為一次繼代時間，繼代時選擇結構松散、質地較硬、顏色淡綠、表面有球形結構的愈傷組織進行選擇性轉移，同時將松軟、白色、褐變的愈傷組織淘汰。經(jīng)過3～5次繼代培養(yǎng)，結合顯微觀察，根據(jù)愈傷組織誘導結果，找到誘導冰燈玉露松散型胚性愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方。

2 結果與分析

2.1 松軟型冰燈玉露愈傷組織誘導結果

將冰燈玉露葉片接種到誘導培養(yǎng)基表面，經(jīng)過3～5 d培養(yǎng)，葉片開始膨大，有些處理傷口出現(xiàn)少量愈傷組織。經(jīng)過大約30 d的培養(yǎng)，每個處理誘導的情況各不一樣，具體情況見表1。

從表1可以看出，在所用培養(yǎng)基上都可以誘導出愈傷組織。從2，4-D的濃度來看，1 mg·L-1的誘導效果比2 mg·L-1要差一些，說明較高濃度2，4-D更容易誘導出愈傷組織。本試驗曾嘗試4 mg·L-1的2，4-D，但誘導效果不如2 mg·L-1。從滲透壓來看，低滲透壓也利于愈傷組織的誘導，1/2MS明顯好于MS，20 g·L-1蔗糖要好于30 g·L-1蔗糖。從誘導出的愈傷組織質地和生長速度來看，低滲透壓誘導出的愈傷組織質地松軟、生長速度明顯較快，相反，高滲透壓誘導出的質地較硬，生長速度較慢，這類愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)很容易誘導出原球莖，但這是本試驗不想誘導出的愈傷組織類型。因此，最后采用1/2 MS+2 mg·L-12，4-D+20 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基作為冰燈玉露松軟型愈傷組織的誘導配方。

2.2 松散型冰燈玉露愈傷組織誘導結果

將上一步驟誘導出的松軟型愈傷組織轉移到新的培養(yǎng)基上進行松散型愈傷組織的誘導。由于愈傷組織比較松軟，因此，在進行愈傷組織轉移過程中應小心夾取，盡可能保持較大塊的愈傷組織被轉移，因為愈傷組織塊過小在轉移培養(yǎng)的初期會很容易死亡，導致無法進行下一步試驗。愈傷組織初次繼代時多數(shù)培養(yǎng)基上的變化仍然較小，經(jīng)過2次繼代和繼代時的有目的的取舍，在不同培養(yǎng)基上愈傷組織會出現(xiàn)明顯的差異，具體情況見表2。

從表2可以看出，不同激素組合對冰燈玉露愈傷組織生長的影響差異顯著。首先，單獨使用BA或2，4-D時愈傷組織生長緩慢并且一直保持松軟狀態(tài)，隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織基本都死亡，這說明，松軟愈傷組織如果不在BA和2，4-D共同作用下很難轉變成質地松散的愈傷組織。其次，采用較低濃度BA并在適當濃度2，4-D的作用下，松軟愈傷組織基本可以轉變?yōu)樗缮⑿陀鷤M織，而且生長速度較快，而在較高濃度BA（2 mg·L-1）時，即使改變2，4-D的濃度愈傷組織也很難轉變?yōu)樗绍浀挠鷤M織，而且愈傷組織基本死亡，即使存活一些，這些愈傷組織最終都會發(fā)展成為緊密型的綠色愈傷組織，而不是試驗所需要的松散型愈傷組織。所以，綜合以上愈傷組織生長情況，選擇MS+1 mg·L-1BA+0.5 mg·L-12，4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基進行愈傷組織的培養(yǎng)，經(jīng)過3～5次繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)時選擇質地較硬、結構松散的愈傷組織進行轉移，最終獲得結構松散的愈傷組織。

2.3 冰燈玉露松散型胚性愈傷組織誘導結果

將上一步驟誘導出的冰燈玉露松散型愈傷組織轉移到含有不同激素的MS培養(yǎng)基上，進行松散型胚性愈傷組織的誘導。經(jīng)過幾次繼代培養(yǎng)，愈傷組織逐漸出現(xiàn)結構與生長的變化，在不同培養(yǎng)基上的表現(xiàn)不同，具體情況見表3。

從表3可以看出，不同激素配比對于冰燈玉露松散型胚性愈傷組織的形成影響較大。首先，在2，4-D濃度不變，且處于低濃度（0.5 mg·L-1）時，隨著BA濃度的增加愈傷組織質地從松散型向緊密型轉變，顏色也從白色過渡到綠色，生長速度和胚性化的變化主要依賴于BA/2，4-D的比值，當BA為2 mg·L-1，2，4-D為0.5 mg·L-1時，愈傷組織生長速度最快，愈傷組織胚性化程度最高。其次，在較低濃度BA，不同濃度2，4-D作用下，愈傷組織雖然都為松散型愈傷組織，但其胚性化程度不高，只在0.5 mg·L-1BA+0.5 mg·L-12，4-D激素配比時才有部分愈傷組織出現(xiàn)胚性化。因此，綜上結果，將冰燈玉露松散型愈傷組織轉移到MS+2 mg·L-1BA+0.5 mg·L-12，4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過2～3次繼代培養(yǎng)即可獲得冰燈玉露松散型胚性愈傷組織。

3 結論與討論

本試驗的目的是誘導松散型胚性愈傷組織，但在誘導初期首先進行了松軟型愈傷組織的誘導，其主要原因是結構松散的愈傷組織細胞之間聯(lián)系較少。在愈傷組織初步誘導時，如果是結構緊密型的愈傷組織，組織細胞之間聯(lián)系緊密，隨著細胞分裂與生長，細胞間的空隙會越來越少，這樣就不能形成結構松散的愈傷組織。但初步誘導出松軟的愈傷組織后，這些組織主要由兩種細胞組成，一是巨大型細胞，這種細胞比正常細胞大幾倍或幾十倍，液泡巨大，幾乎沒有細胞質，并且不能分裂，這類細胞一般是成熟細胞吸水膨大形成的，隨著培養(yǎng)時間的延長細胞解體死亡；另一種是細胞較小，細胞質濃，分裂旺盛，這類細胞主要由分生組織細胞發(fā)育而來。以上兩種細胞的比例決定著愈傷組織的質地，一般巨大型細胞較多時，愈傷組織為松軟或稀軟型，而小的細胞多時，愈傷組織質地會相對緊密，隨著進一步的培養(yǎng)大細胞死亡，這會造成小細胞之間出現(xiàn)一定數(shù)量的空隙，從而導致細胞之間的聯(lián)系分散，容易誘導出松散型的愈傷組織。因此，本試驗在誘導冰燈玉露松散型胚性愈傷組織之前先進行松軟型愈傷組織的誘導。

本試驗通過一系列試驗，最終獲得了冰燈玉露松散型胚性愈傷組織。具體步驟為先以冰燈玉露組培苗葉片為外植體，在1/2 MS+2 mg·L-12，4-D+20 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上誘導出松軟的愈傷組織。然后將這些松軟的愈傷組織轉接到MS+1 mg·L-1 BA+0.5 mg·L-12，4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上，經(jīng)過3～5次繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)時選擇質地較硬、結構松散的愈傷組織進行轉移，最終獲得結構松散的愈傷組織。再將這些松散型愈傷組織在MS+2 mg·L-1BA+0.5 mg·L-12，4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過2～3次繼代培養(yǎng)即可獲得冰燈玉露松散型胚性愈傷組織。這種愈傷組織在MS培養(yǎng)基上可以發(fā)育成球形胚，繼而發(fā)育成完整的胚狀體，并最終成苗。

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