西藏拉魯濕地土壤酵母菌多樣性及產胞外酶活性菌株分布特性研究

郝 兆，梁澤鵬，熊 寧，拉 巴，德 吉，郭小芳

（西藏大學理學院，西藏 拉薩 850000）

西藏拉魯濕地土壤酵母菌多樣性及產胞外酶活性菌株分布特性研究

郝 兆，梁澤鵬，熊 寧，拉 巴，德 吉，郭小芳

（西藏大學理學院，西藏 拉薩 850000）

采用平板稀釋法從西藏拉魯濕地土壤中分離酵母菌，開展城市濕地酵母菌多樣性研究。結合經典分類法及26S rDNA D1/D2區域序列分析，對獲得的酵母菌菌株進行系統分類，并進行產胞外酶活性菌株的皿內初篩。結果顯示，分離得到的83株酵母菌分屬于隱球菌屬Cryptococcus、假絲酵母屬Candida、原囊菌屬Protomyces、紅酵母屬Rhodotorula及孢囊線黑粉酵母Cystofilobasidium等5個屬16個種，其中膠紅酵母Rhodotorula mucilaginosa相對豐度最高，約26%，其次為維多利亞隱球酵母Cryptococcus victoriae和山楊隱球酵母Cryptococcus aspenensis；多樣性分析表明，LhWS6樣點的酵母菌多樣性最豐富，LhWS9樣點則最低；產胞外酶活性菌株初篩結果表明，25℃下產脂肪酶活性菌株比例最高，為67%，而4℃下產淀粉酶活性菌株數最多，為49株。另外，低溫條件下產淀粉酶、果膠酶、纖維素酶和幾丁質酶的活性菌株比例均高于常溫條件。結果表明拉魯濕地土壤酵母菌總體種類較豐富，但每個樣點的種類相對單一，說明濕地生境或人為活動一定程度影響到該生態環境酵母菌的種群分布，開發青藏高原耐低溫、產胞外酶等活性菌株具有一定的應用前景。

拉魯濕地；土壤；酵母菌多樣性；26 SrDNA D1/D2

微生物是生物地球化學循環的主要驅動者，其群落組成和活性影響著生態系統轉化的方向和進程［1］。開展微生物多樣性及其功能特性研究對于闡明微生物群落與其生境的關系、開發微生物資源意義顯著。

青藏高原是世界上海拔最高、面積最大而獨特的生態系統，高寒、缺氧、輻射強等因素相互作用形成了其特殊的自然地理環境，同時孕育了大量豐富而特殊的微生物資源。國內外學者對青藏高原微生物多樣性開展了較為廣泛的研究［2］，但其中酵母菌的研究未見文獻報道。

濕地為水生、陸生生態系統界面相互延伸擴展的重疊空間區域，是地球上特殊過渡類型生態系統，也是自然界富有生物多樣性的生態景觀和人類重要的生存環境之一，具有多種生態功能和社會經濟價值，被譽為“自然之腎”［3］。微生物是濕地生態系統的重要組成部分，不僅在濕地生態系統物質循環、能量流動和系統穩定性維持等方面具有重要作用，而且還參與廢物處理、生態修復、氣體調節和生物多樣性保護等生態過程［4］。拉魯濕地是目前我國城市范圍內面積最大的天然濕地，其在保持地區生物多樣性、維持城市生態平衡、改善城市環境質量等方面起著十分重要的作用，故有拉薩“城市之肺”之稱［5］。盡管拉魯濕地具有重要的生態作用，但是由于地域等條件的限制，對其中生物資源和多樣性的研究起步比較晚，且主要集中在植物群落結構［6］、土壤動物［7-11］、昆蟲資源［12］、鳥類［13-14］及魚類多樣性［15］等的研究，而微生物方面僅見零星報道，也僅局限于土壤放線菌和細菌的研究［16-17］，拉魯濕地酵母菌相關研究則尚未開展。本研究旨在開展拉魯濕地土壤酵母菌多樣性及產胞外酶活性菌株篩選等研究，期望為青藏高原酵母菌資源的開發利用及菌種資源庫的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣點設置

在拉魯濕地保護區（91°05′54″～91°06′16″E，29°40′02″～29°41′01″N）設置10個樣點，各樣點地理位置及生境見表1，采樣點見圖1。

表1 拉魯濕地土壤采樣點概述

圖1 拉魯濕地土壤采樣點分布

1.2 土樣采集

2015年10月份，在拉魯濕地選擇植被類型具有代表性的10 個樣點進行土樣采集。每個樣點設置3 m×6 m樣方，去除樣方表面雜質，采用多點混合法采集0～30 cm深度的土壤樣品，裝入無菌密封袋中，帶回實驗室及時進行酵母菌的分離。

1.3 酵母菌的分離純化及保藏

取土樣10 g，加入無菌水90 mL，振蕩20 min制成土壤菌懸液。分別稀釋至10-2、10-3并取200 μL涂布于酸化YPD、酸化YM及酸化PDA平板上，培養3～5 d后逐一記錄酵母菌菌落數，并采用平板劃線法在YPD培養基上進行純化，用甘油管保藏純化的菌株。

1.4 酵母菌的分類鑒定

采用形態觀察和26 SrDNA D1/D2區域序列分析相結合的方法進行菌株鑒定。供試菌株26 S rDNA D1/D2測序結果采用DNAStar軟件進行圖譜分析，對序列進行人工校對后在GenBank核酸序列數據庫中進行同源性搜索（BLAST search）。然后選取與供試菌株關系較近的模式菌株的26 SrDNA D1/D2區域序列比較其相似程度，并 確定菌株的分類地位。

1.5 產胞外酶活性酵母菌菌株初篩

利用模擬仿真的方法對提出模型的性能進行測試和比較分析。失蹤物體在落水后，將會在風、流和浪等自然環境因素的影響下離開初始事故地點[11]，當漂移到岸邊后，將會由于水深較淺而停留在岸邊。

1.5.1 酵母菌菌株活化 將甘油管內保藏的酵母菌株涂布在YPD斜面上，室溫或25℃培養24～72 h。

1.5.2 培養基平板制備 淀粉酶培養基：可溶性淀粉20 g，蛋白胨20 g，酵母粉 10 g，曲利酚藍溶液（1.0%）10 mL，瓊脂20 g，水1 000 mL。纖維素酶培養基：羧甲基纖維素鈉2 g，硫酸銨 2 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鈉0.5 g，剛果紅0.4 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。脂肪酶培養基：蛋白胨10 g，NaCl 5 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，吐溫80 10 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。果膠酶培養基：果膠4 g，蛋白胨10 g，氯化鈉0.5 g，剛果紅0.15 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。幾丁質酶培養基：膠狀幾丁質15 g，酵母粉5 g，（NH4）2SO41 g，MgSO45H2O 0.3 g，KH2PO41.36 g，水1 000 mL。

1.5.3 活性菌株初篩 將活化后的酵母菌接種于5 種產酶菌株篩選培養基，分別于4℃培養21 d、25℃培養5 d后，觀察透明圈或暈圈大小，并記錄結果。

1.6 數據處理

試驗數據采用Excel軟件計算Shannon-Wiener多樣性指數（H’）、Pielou均勻度指數（J’）及Simpson多樣性指數（D）。

2 結果與分析

2.1 拉魯濕地土壤中酵母菌群落組成分析

利用經典分類法及 26SrDNA D1/D2區域序列分析法對拉魯濕地土壤中的酵母菌其進行鑒定，結果（表2）顯示，擔子菌綱（3個屬14個種）相對豐度高達99.57%，而子囊菌綱僅包括2個屬2個種，相對豐度僅為0.43%，可以看出，拉魯濕地土壤中，擔子菌綱酵母占明顯優勢。由表2可知，拉魯濕地土壤酵母菌分屬5個屬16 種，其中隱球菌屬種類最多，為8個種，其次為紅酵母屬（4個種），孢囊線黑粉酵母Cystofilobasidium為2個種，原囊菌屬和假絲酵母屬均為1個種。

酵母菌屬水平相對豐度以紅酵母屬最高、為46.77%，其次為隱球菌屬（44.75%），而原囊菌屬、假絲酵母屬相對豐度最低（均為0.22%），表明隱球菌屬和紅酵母屬是拉魯濕地土壤中酵母菌的優勢屬。酵母菌種水平相對豐度以膠紅酵母最高、為25.86%，其次為維多利亞隱球酵母Cryptococcus victoriae（17.03%）和山楊隱球酵母Cryptococcus aspenensis（14.65%），而假絲酵母Candida sake、氣生隱球酵母Cryptococcusaerius、鹿角原囊菌Protomycesinundatus均只分離到1株，相對豐度只有0.22%。Cryptococcus victoriae分布相對廣泛，出現頻率為50%，其次為粘紅酵母Rhodotorulaglutinis，出現頻率為40%，Cryptococcus aspenensis、膠紅酵母Rhodotorula mucilaginosa、香草紅酵母Rhodotorulavanillica分布不太廣泛，出現頻率僅為20%，而其余11種酵母均僅分布于一個樣點。

表2 拉魯濕地土壤酵母菌種群分布狀況

2.2 拉魯濕地不同樣點土壤酵母菌組成相似性分析

表3表明，除LhWS3與LhWS5、LhWS8，LhWS8與LhWS5、LhWS7間相似性系數為0.5，屬于中度相似外，其他樣點間的Jaccard相似性系數均分布于0～0.25，屬于極不相似，尤其是樣點LhWS9、LhWS10與其他各樣點之間相似性系數均為0。總體而言，拉魯濕地各個樣點土壤酵母菌種群分布差異較大。

表3 拉魯濕地不同土壤樣點酵母菌種類Jaccard相似性系數

2.3 拉魯濕地土壤酵母菌多樣性分析

從表4可以看出，拉魯濕地每個土壤樣品中分離的酵母菌種類均不多，最多為3 種，最少的為1種（LhWS9樣點）；LhWS6樣點可培養酵母菌數量最多，其次為LhWS2樣點，LhWS9樣點則最少，僅為5×102CFU/g。

Shannon-Wiener多樣性指數以LhWS6樣點最高，為1.10，其次為LhWS7和LhWS2樣點，均超過0.90，LhW3、LhWS5、LhWS10 3個樣點介于0.80～0.90之間，LhWS9樣點最低（僅為0），LhWS8樣點也較低；Simpson多樣性指數以LhWS6樣點最高，LhWS9為最低；Pielou均勻度指數除LhWS9樣點為0外，其他樣點間差距不明顯。綜合3種多樣性指數可以看出，LhWS6樣點土壤酵母菌多樣性最豐富且多樣，其次為LhWS7和LhWS2樣點，LhWS9樣點酵母菌分布明顯單一，LhWS8樣點酵母菌多樣性也不太豐富。

表4 拉魯濕地不同土壤樣點酵母菌多樣性指數

2.4 拉魯濕地土壤產胞外酶活性酵母菌分布特性

2.4.1 拉魯濕地土壤16種酵母菌產胞外酶活性菌株數比較 表5結果顯示，被測的83株酵母菌中，4℃條件下，產淀粉酶活性菌株最多（49株），其次為產脂肪酶活性菌株，而產幾丁質酶活性菌株數則最少，僅占總菌株的4%。除僅分離到1株的5種酵母菌外，產淀粉酶活性菌株比例最高的為Rhodotorulavanillica，其次為Cryptococcus aspenensis、粘紅酵母Rhodotorula glutinis、Cryptococcus victoriae；產脂肪酶活性菌株比例最高的為Rhodotorulaglutinis，比例高達82%，其次為Cryptococcus victoriae（61%）；產纖維素酶活性菌株比例最高的為烏茲別克斯坦酵母Cryptococcusuzbekistanensis，其次為阿德利隱球酵母Cryptococcusadeliensis、乳酪隱球酵母Cryptococcusfriedmannii；產果膠酶活性菌株比例最高為禾谷隱球酵母Cryptococcuscerealis、其次為膠紅酵母Rhodotorula mucilaginosa。比較占優勢的兩個屬的產胞外酶活性菌株比例可以看出，紅酵母Rhodotorula產淀粉酶和產脂肪酶活性菌株比例高于隱球酵母Cryptococcus，Cryptococcus產果膠酶活性菌株比例較高，Rhodotorula和Cryptococcus產纖維素酶活性菌株差不多，產幾丁質酶的活性菌株均為Cryptococcus。

表6結果表明，25℃條件下，產脂肪酶活性菌株最多，比例為61%，其次為產淀粉酶活性菌株，而產幾丁質酶活性菌株則沒有。比較占優勢的兩個屬的產胞外酶活性菌株比例，可以看出，Cryptococcus產脂肪酶活性菌株比例較高，而產淀粉酶活性菌株比例則相反，果膠酶和纖維素產生能力兩者差不多。分析產不同胞外酶活性菌株比例（除僅分離到1株的5種酵母菌外），可以看出，產淀粉酶活性菌株比例最高的為Cryptococcusfriedmannii和Cryptococcuscerealis，

其次為Rhodotorulavanillica；產脂肪酶活性菌株比例最高的為Cystofilobasidium macerans（100%） ，其次為Rhodotorulaglutinis（94%），Cryptococcus victoriae產脂肪酶活性菌株比例也比較高，為72%；產纖維素酶活性菌株比例最高的為Cryptococcuscerealis、其次為Cryptococcus adeliensisi；產果膠酶活性菌株比例最高為浸麻孢囊線黑粉酵母Cystofilobasidium macerans，其次為Cryptococcusuzbekistanensis。

表5 拉魯濕地土壤中不同酵母菌產胞外酶活性菌株數比較（4 ℃）

表6 拉魯濕地土壤中不同酵母菌產胞外酶活性菌株數比較（25 ℃）

比較不同溫度下拉魯濕地產胞外酶活性菌株，從表5、表6可以看出，25℃條件下，產脂肪酶活性菌株比例明顯高于低溫條件，相反，4℃條件下產淀粉酶、纖維素酶及果膠酶活性菌株比例則高于25℃，另外，產幾丁質酶活性菌株則只在4℃條件下被篩選到。

2.4.2 拉魯濕地不同樣點土壤酵母菌產胞外酶活性菌株數比較 從表7可以看出，4℃條件下，幾丁質酶活性菌株主要出現在LhWS4和LhWS5樣點，產淀粉酶活性菌株比例最高的樣點為LhWS3、LhWS9和LhWS10，均為100%，產脂肪酶菌株比例最高的樣點則為LhWS3和LhWS7，而LhWS5樣點產果膠酶活性菌株比例最高，LhWS2樣點產纖維素酶活性菌株比例最高。另外，LhWS9和LhWS10樣點僅有淀粉酶活性菌株被篩選到。

表7 拉魯濕地不同樣點土壤酵母菌產胞外酶活性菌株數比例（%，4℃）

表8數據顯示，25℃產淀粉酶活性菌株比例最高的樣點為LhWS2，其次為LhWS3、LhWS5和LhWS7樣點；產脂肪酶菌株比例最高的樣點則為LhWS7，其次為LhWS3、LhWS2和LhWS1樣點；而LhWS3樣點產纖維素酶和果膠酶活性菌株比例最高。另外，LhWS9樣點未檢測到產5種胞外酶活性菌株，LhWS10僅有產淀粉酶活性菌株被篩選到。

表8 拉魯濕地不同樣點土壤酵母菌產胞外酶活性菌株數比例（%，25℃）

比較表7和表8數據可以發現，除LhWS3以及未篩選出脂肪酶活性菌株的LhWS9和LhWS10樣點外，其他7個樣點高溫條件下的產脂肪酶活性菌株比例均高于低溫條件；而產淀粉酶活性菌株比例除LhWS2樣點外，其他樣點低溫條件下的產脂肪酶活性菌株比例均不低于高溫條件；產纖維素酶活性菌株比例除LhWS6樣點外，其他樣點低溫條件下活性菌株比例仍均不低于高溫條件；產幾丁質酶活性菌株僅于低溫條件下，在LhWS4和LhWS5樣點被分離到。

3 結論與討論

分離自拉魯濕地土壤83株酵母菌，經26 SrDNA D1/D2區域序列分析法進行鑒定，被歸為5個屬16個種。多樣性分析結果顯示，LhWS6樣點多樣性指數最高，LhWS9樣點酵母菌最為單一；Jaccard相似性系數顯示，LhWS3樣點與LhWS5、LhWS8樣點之間相似性系數為0.5，LhWS8樣點與LhWS5樣點、LhWS7 樣點也屬于中等相似。分析這些樣點的采樣生境，可以看出，它們都屬于人類活動影響相對明顯的生境；而LhWS9樣點為沙石沖擊區、LhWS10樣點屬于沼生群落生境，特殊的生境可能是導致它們與其他樣點酵母菌種類極不相似的原因。

由于濕地土壤酵母菌多樣性研究未見相關文獻報道，只能將青藏高原其他高海拔地區土壤酵母菌與本研究的結果進行分析比較。徐美鑫等［18］研究了青海東部土壤的酵母物種多樣性，從青海的互助、民和、門源等10個州縣收集土樣并分離得到98株酵母菌，26 S rDNA D1/D2區域序列分析結果顯示，這些酵母菌分屬于10個屬13個種。分析兩個不同地域酵母菌種類，可以看出，除3種酵母菌（Cryptococcus aerius、Cryptococcu.uzbekistanensis、Rhodotorula mucilaginosa）為共同存在的種類外，其他的都不同。比較本研究發現，拉魯濕地土壤酵母菌屬數雖然不多，但種數卻明顯多于青海同一地區土壤中酵母菌（最多為10 種），說明拉魯濕地酵母菌總體上多樣性比較豐富。然而就每個樣點而言，種類相對單一，最多為3種，個別樣點僅分離到1株酵母，因此盡快開展青藏高原相對脆弱生態環境微生物資源的開發利用至關重要。

LhWS9和LhWS10樣點酵母產胞外酶活性結果表明，這3個樣點低溫條件下除淀粉酶外，不能產生其他4種胞外酶，可能與樣點所處生境及植被類型有一定關系，這些樣點相對植被覆蓋度較低甚至無植物生長，導致其中營養物質可能貧乏，因此酵母菌產胞外酶的類型相對單一。另外，LhWS7樣點無論低溫還是常溫條件下，產脂肪酶活性菌株比例明顯較高，這可能是因為該樣點為拉薩市城關區居民生活污水進入拉魯濕地的入水處，其中含有的物質或生活垃圾等的堆積導致該樣點產脂肪酶酵母菌比例高于其他樣點。總體而言，雖然采樣點分布較集中，但是因為各個樣點生境類型具有一定的特色，因此各個樣點間相似性相對較低，絕大多數樣點間呈極度不相似。此結果從某種程度上說明，微生物所處生境類型或人類活動會一定程度地影響其種群分布。

考慮到拉魯濕地地處高原高寒、缺氧條件，可能會存在更多耐低溫的酵母菌，因此在篩選產胞外酶活性菌株時，本研究設置25、4℃兩種條件進行。結果顯示，低溫條件下50%以上（49株）酵母菌能夠至少產1種胞外酶，其中10株酵母菌能夠產生3種胞外酶。本研究結果還表明，產脂肪酶活性菌株比例25℃條件下高于低溫條件，相反，4℃條件下產淀粉酶、纖維素酶及果膠酶活性菌株比例則高于25℃，另外，產幾丁質酶活性菌株則只在4℃條件下被篩選到。這一方面可能是因為高原環境更有利于耐低溫酵母菌菌株的生存，另外，也與我們在分離過程中采用的培養溫度有關，其中有32株酵母菌活化時僅在拉薩秋冬季室溫下生長，而不能在25℃恒溫條件下得到活化。因此，開發青藏高原耐低溫、產胞外酶或其他特殊功能的酵母菌資源具有廣闊的前景。

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（責任編輯 鄒移光）

Yeast diversity and distribution characteristics of activity strains producing extracellular enzyme in soil of Lhalu Wetland，Tibet

HAO Zhao，LIANG Ze-peng，XIONG Ning，LA Ba，DE Ji，GUO Xiao-fang
（School of Science，Tibet University，Lhasa 850000，China）

In this paper，we isolated yeasts from soil of Lhalu Wetland using the dilution method. In addition，we used 26S rDNA D1/D2 domain sequence analysis and traditional methods to identify isolates and screened extracelluar enzyme activity strains in petri dish. 83 yeast isolates were identified as belonging to 16 species of 5genera，includingCryptococcus，Candida，Protomyces，RhodotorulaandCystofilobasidium.R. mucilaginosawas the most species in soil of the wetland，moreover，the relative abundance ofCryptococcus victoriaeandCryptococcus aspenensiswas also high. Diversity indices showed that yeast isolates in the LhWS6 site were most abundant，however，that of the LhWS9 site were the lowest. The study showed that human activities had influences on spatial dynamics of yeast community in Lhalu Wetland. The test also manifested that the percentage of lipase activity strains was the highest at 25℃，however，the number of strains produced amylase most at 4℃，up to 49 isolates. Furthermore，the percentage of isolates producing amlyse，pectinase，cellulase and chitinase was higher in cold condition. Yeasts distributing in soil of Lhalu Wetland were abundant，but insingle site，the kind was few，which indicated that the wetland habitat or human activity could effect population distribution，and it was important to exploit low temperature-tolerant or exoenzyme activity microorganism in Qinghai-Tibet plateau.

Lhalu Wetland; soil; yeast diversity; 26 SrDNA D1/D2

S154.3

A

1004-874X（2017）04-0099-09

郝兆，梁澤鵬，熊寧，等. 西藏拉魯濕地土壤酵母菌多樣性及產胞外酶活性菌株分布特性研究［J］.廣東農業科學，2017，44（4）：99-107.

2016-10-12

國家級大學生創新創業訓練項目（201510694003）；西藏自治區自然科學基金（2016ZR-15-11）；2016年度西藏大學珠峰學者人才發展支持計劃（藏大字［2016］141號）

郝兆（1995-），男，在讀本科生，E-mail：51392080@qq.com

郭小芳（1982-），女，碩士，副教授，E-mail：gxf005@hotmail.com