雙歧桿菌對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸損傷及腸道菌群的影響

郭慧慧，宋慧，李婷，王淑媛，衛(wèi)佳麗

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.吉大白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠，吉林長春130118）

雙歧桿菌對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸損傷及腸道菌群的影響

郭慧慧1，宋慧2，李婷2，王淑媛1，衛(wèi)佳麗1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.吉大白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠，吉林長春130118）

本文探討雙歧桿菌M IMBb75對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸損傷及腸道菌群的影響。試驗采用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎，隨機分成7組：正常對照組、模型組、MRS-L培養(yǎng)基陰性對照組、美沙拉嗪陽性對照組、M IMBb75高劑量組、M IMBb75中劑量組及M IMBb75低劑量組，給藥7天后處死小鼠，進行結(jié)腸長度、血中血紅蛋白濃度及腸道菌群檢測。結(jié)果顯示：雙歧桿菌能夠有效抑制潰瘍性結(jié)腸炎引起的小鼠血中血紅蛋白濃度的下降，可以抑制潰瘍性結(jié)腸炎引起的結(jié)腸長度的縮短；可以增加腸道菌群多樣性，提高擬桿菌屬及柔嫩梭菌的數(shù)量。說明雙歧桿菌通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)失調(diào)，對潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)揮治療作用。

雙歧桿菌M IMBb75；結(jié)腸炎；結(jié)腸損傷；DGGE；腸道菌群

潰瘍性結(jié)腸炎（ul c e r a t i v e c o l i t is，U C）是一種無地域差異、無種族差異的人群多發(fā)性腸道炎癥疾病，主要表現(xiàn)在結(jié)腸、直腸的粘膜和粘膜下層受損引發(fā)炎癥[1]。U C的臨床表現(xiàn)主要以腹痛、腹瀉、粘液膿血便以及不同程度的全身癥狀[2]，其病因尚不明確，目前認為，U C的發(fā)病可能與腸腔內(nèi)部抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)過度激活相關(guān)[3]。隨著微生態(tài)學(xué)的發(fā)展，腸道微環(huán)境作為一個復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)與U C的發(fā)病有著緊密的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，U C患者腸道菌群失調(diào)，致病菌和條件致病菌增多，導(dǎo)致腸道粘膜通透性增加，而細菌代謝產(chǎn)物向粘膜固有層移位，引起免疫細胞的激活，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[4]。一系列研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎患者體內(nèi)雙歧桿菌及乳酸菌等有益菌數(shù)量下降，大腸桿菌腸球菌等有害菌數(shù)量增多，提示腸道菌群可能參與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生與發(fā)展。雙歧桿菌是近年來被認可的益生菌，具有增強免疫力、抗衰老、抗腫瘤等生理功能，尤其是對腸道菌的平衡有很好的作用。本試驗旨在研究雙歧桿菌對U C小鼠結(jié)腸損傷及腸道菌群的影響。

1 材料

1.1 試驗動物

清潔級昆明小鼠64只，體重18～22克，雌雄對半。來源：吉林大學(xué)動物實驗室。昆明鼠在理科樓分子病學(xué)研究室進行為期7天的適應(yīng)性喂養(yǎng)。

1.2 藥品

美沙拉嗪腸溶片購于葵花藥業(yè)有限公司；雙歧桿菌（M I M Bb75）由吉大藥廠饋贈，調(diào)節(jié)為108C FU/m L，107C FU/m L，106C FU/m L三個不同的濃度。

1.3 主要試劑

文-齊氏液（H i C N化高鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化液）購于上海榕柏生物技術(shù)有限公司；葡聚糖硫酸鈉（D SS，分子量36000～50000），購自美國M P B io m e d i c a l s公司。

1.4 主要儀器

低速離心機，購自上海安亭科學(xué)儀器廠；立式壓力蒸汽滅菌器，購自上海申安醫(yī)療器械有限公司；水浴鍋，購自上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司；P C R儀，購自T he r m o S C I E N T IF I C；電泳儀，購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；D GG E電泳儀，購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；凝膠成像儀，購自上海器仁儀器儀表有限公司。

2 方法

2.1 試驗動物分組及給藥

63只清潔級昆明小鼠隨機分為7組，每組9只。分別為空白組、D SS模型組、M R S-L培養(yǎng)基陰性對照組、美沙拉嗪陽性對照組、雙歧桿菌高劑量組、雙歧桿菌中劑量組及雙歧桿菌低劑量組。各組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，空腹處理4小時，除空白組外，其余各組自由飲用3%葡聚糖硫酸鈉（D SS）且分別灌胃0.4m L M R S-L培養(yǎng)基，美沙拉嗪以及不同濃度的M I M Bb75培養(yǎng)液。

2.2 結(jié)腸損傷相關(guān)指標檢測

結(jié)腸長度測定∶取整段結(jié)腸，量取長度并記錄；血紅蛋白測定：文-齊氏液檢測各小鼠血中血紅蛋白濃度，具體操作依照說明書進行。

2.3 腸道菌群檢測

樣品預(yù)處理：從-80℃冰箱中取出腸道菌群檢測樣品，將樣品置于-20℃冰箱中1小時，再在冰盒上解凍20分鐘。滅菌的2亳升離心管除皮稱重，挑取0.2克左右混合物于離心管中，采用酚／氯仿／異戊醇法提取進行腸道內(nèi)容物腸道菌DN A提取。P C R-D GG E檢測腸道菌群多樣性，取D GG E圖譜的共性條帶及特異性條帶進行克隆測序，具體方法參照曾巧莉等人研究結(jié)果[5]。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用s p ss23.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，采用F檢驗對正交試驗結(jié)果進行差異性分析，用P＜0.05表示差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 各組小鼠結(jié)腸損傷相關(guān)指標測定

飲用D SS以后，與對照組相比，模型組與M R S-L陰性對照組小鼠血中血紅蛋白濃度及結(jié)腸長度發(fā)生明顯改變，血紅蛋白濃度下降，結(jié)腸長度縮短，與空白組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明模型組小鼠結(jié)腸炎相關(guān)指標發(fā)生改變，并且M R S-L對D SS引起的結(jié)腸損傷無明顯的改善作用，見表1。與模型組相比，美沙拉嗪陽性對照組及雙歧桿菌（M I M Bb75）各處理組血紅蛋白濃度及結(jié)腸長度發(fā)生改變，血紅蛋白濃度升高，結(jié)腸長度增加，與模型組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明雙歧桿菌（M I M Bb75）對D SS引起的結(jié)腸損傷具有一定的抑制作用，見表1。

3.2 MIMBb75對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的影響

3.2.1 M IMBb75對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道菌群多樣性的影響將P C R-D GG E圖譜（圖1）各組的條帶數(shù)進行分析（表2），與空白組相比，M I M Bb75高劑量組及中劑量組DN A條帶數(shù)均顯著升高（P＜0.05）；與D SS模型組相比M I M Bb75高劑量組、中劑量組、低劑量組及美沙拉嗪組DN A條帶數(shù)均顯著升高（P＜0.05）；而與D SS對照組相比，M R S處理組DN A條帶數(shù)無顯著差異。

表1 各組小鼠血紅蛋白濃度和結(jié)腸長度檢測結(jié)果

表2 M IMBb75對小鼠腸道菌群條帶數(shù)的影響

圖1 不同處理組腸道內(nèi)容物DGGE圖譜1～3空白組1-3 Control group；4～6 MRS培養(yǎng)基對照組；4-6 MRS group；7～9M IMBb75∶1×108cfu/m l；10～12 M IMBb75∶1× 107cfu/m l；13～15M IMBb75∶1×106cfu/m l；16～18DSS；19～21Mesalazine

圖內(nèi)數(shù)字為條帶編號，N u m b e r s in t he p r o f l ies is ge l b an d n u m b e r.

3.2.2 M IMBb75對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道菌群相似性的影響

由圖2可看出，M I M Bb75中劑量組與M I M Bb75高劑量組相似性系數(shù)為49.8%，M I M Bb75低劑量組與M I M Bb75高劑量組相似性系數(shù)為45%，美沙拉嗪對照組與M I M Bb75高劑量組相似性系數(shù)為33.9%，M R S對照組與M I M Bb75高劑量組相似性系數(shù)為41%，D SS模型組與M I M Bb75高劑量組相似性系數(shù)為39%，空白組與M I M Bb75高劑量組相似性系數(shù)為39.4%，由結(jié)果可以看出，M I M Bb75不同劑量組間的相似性均高于與空白組、美沙拉嗪組及D SS模型組的相似性。

圖2 不同處理組小鼠PCR-DGGE圖譜條帶的聚類分析圖1～3空白組1-3 Control group；4～6 MRS培養(yǎng)基對照組；4-6 MRS group；7～9M IMBb75∶1×108cfu/m l；10～12 M IMBb75∶1× 107cfu/m l；13～15 M IMBb75∶1×106cfu/m l；16～18 DSS；19～21Mesalazine

3.2.3 M IMBb75對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道微生物種類的影響

表3可見，由于擴增出細菌的16S rDN A的V3區(qū)片段大小為200b p，而克隆僅能測出170b p左右。本實驗并未檢測出乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌等優(yōu)勢菌群，主要以擬桿菌屬、柔嫩梭菌屬、多形桿菌為主，對比結(jié)果顯示，1、6、12、14和16作為共性條帶，分別為擬桿菌屬B a r nesie ll a in t es t iniho m inis、多形桿菌B a ct e r oi d es、檸檬酸桿菌[C i tr o b a ct e r]，M I M Bb75處理組特異性條帶為4、5、7、8、9、10、11、13、15、16、17、19和20，主要為擬桿菌屬B a r nesie ll a in t es t iniho m inis、柔嫩梭菌[C l os tr i d u m]l e p t u m s tr ain及乳酸發(fā)酵梭菌[C l o tr i d i u m] p o l y sa cc ha r o l y t i c u m s tr ain，可以看出柔嫩梭菌及乳酸發(fā)酵梭菌在各組都存在，且在M I M Bb75處理組更具優(yōu)勢。

表3 DGGE圖譜中條帶的基因片段序列對比

4 結(jié)論與討論

潰瘍性結(jié)腸炎（U C）的發(fā)病機制目前尚不清楚。近年來，隨著遺傳學(xué)、免疫學(xué)以及分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，人們對U C的認識不斷深入[6]。已有研究證明，U C的發(fā)病與環(huán)境因素、遺傳因素、免疫因素以及腸道微生物密切相關(guān)。目前認為，腸道微生物屏障與機體的相互作用可能是U C發(fā)生的重要原因之一[7]。據(jù)報道顯示，益生菌通過抑制N F-k B信號通路發(fā)揮抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的作用[8]。而本試驗結(jié)果顯示，M I M Bb75高劑量組、中劑量組與低劑量組DN A條帶數(shù)顯著升高且M I M Bb75高劑量組與M I M Bb75中劑量組、低劑量組的相似性均較與空白組、M R S培養(yǎng)基陰性對照組、美沙拉嗪組及D SS組相似性高，說明M I M Bb75各劑量組對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)有著相似的調(diào)節(jié)作用。分析可能的原因：雙歧桿菌是益生菌，能夠參與短鏈脂肪酸的合成，從而增強上皮細胞的屏障功能，阻止致病性的大腸桿菌入侵。張玲等研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌三聯(lián)活菌能有效抑制腸道內(nèi)致病菌的生長[9]。徐俊燕等研究發(fā)現(xiàn)，美沙拉嗪聯(lián)合雙歧桿菌四聯(lián)活菌能明顯改善U C的臨床癥狀，促進腸粘膜的愈合[10]。根據(jù)本實驗結(jié)果初步推測，M I M Bb75可以與腸道內(nèi)原有的宿主微生物競爭，抑制有害菌生長，促進有益菌生長，增加小鼠腸道微生物多樣性。

研究發(fā)現(xiàn)，益生菌能給上皮細胞（I E C s）提供重要的能源物質(zhì)，同時共生菌的代謝產(chǎn)物也促進I E C s平衡。微生物能夠介導(dǎo)膳食纖維及糖類物質(zhì)的加工產(chǎn)生短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸和丁酸，而丁酸信號通過G蛋白偶聯(lián)手提(G P R)109A誘導(dǎo)I E C I L-18的表達，從而抑制結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌（C A C）[11]。其他相關(guān)研究證明雙歧桿菌能有衍生乙酸增強腸道上皮細胞抗凋亡反應(yīng)，對腸道損傷發(fā)揮保護作用[12]。本實驗的結(jié)果顯示，M I M Bb75處理組出現(xiàn)了特異性的柔嫩梭菌、乳酸發(fā)酵梭菌及檸檬酸桿菌等，降低腸道p H值，抑制病原微生物的入侵。由此可見，本試驗小鼠結(jié)腸阻止損傷結(jié)果顯示：M I M Bb75各劑量組小鼠血中血紅蛋白濃度升高，結(jié)腸長度增加，結(jié)腸損傷有所改善，這可能與M I M Bb75添加衍生乙酸，降低腸道p H值，營造腸道酸性環(huán)境，抑制有害菌的生長有關(guān)。徐敏等研究發(fā)現(xiàn)益生菌可能通過抑制N F-k B信號通路降低小鼠集體腸道炎癥，改善結(jié)腸炎小鼠的病理學(xué)損傷。根據(jù)本實驗結(jié)果初步推斷，M I M Bb75能夠通過營造有益的腸道微環(huán)境降低腸道p H值，從而有利于腸道有益菌的定制，減少腸道有害菌，改善腸道菌微生態(tài)分布，從而抑制結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸損傷。

[1]陳璐,C H E N L u.潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機制的研究進展[J].疑難病雜志,2016,15(06)∶650-654.

[2]羅鳳燕,白愛平.潰瘍性結(jié)腸炎動物模型的研究進展[J].世界華人消化雜志,2013(07)∶607-613.

[3]C o m i t o D,R o m ano C.D y s b iosis in t he P a t hogenesis o f P e d ia tr i c I n f l a mm a t o r y B o w e l D iseases[J].I n t e r na t iona l J o u r na l o f I n f l a mm a t ion,2012,2012(14)∶687143.

[4]F a v a F,D anese S.I n t es t ina l m i cr o b io t a in in f l a mm a t o r y b o w e l d isease∶f r ien d o f f oe[J].W o r l d j o u r na l o f gas tr oen t e r o l og y, 2011,17(05)∶557.

[5]曾巧莉,宋慧,郭慧慧,等.金針菇菇腳對肉雞盲腸菌群及短鏈脂肪酸的影響[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,21(05)∶104-114.

[6]金博.腸道菌群移植與潰瘍性結(jié)腸炎[J].世界華人消化雜志,2017(01)∶23-30.

[7]B o r o d y T J,C a mp b e ll J.F e c a l m i cr o b io t a tr ans p l an t a t ion∶c u rr en t s t a t u s an d f u t u r e d i r e ct ions[J].E x p e rt R e v ie w o f G as tr oen t e r o l og y&H e p a t o l og y,2011,5(06)∶653.

[8]徐敏,趙莉,杜金城,等.益生菌混合物通過抑制N F-κB信號通路發(fā)揮抗?jié)冃越Y(jié)腸炎功效的研究[J].食品工業(yè)科技, 2016,37(17).

[9]張玲,李昌平,姜政,等.雙歧桿菌三聯(lián)活菌聯(lián)合英夫利昔單抗治療中重度潰瘍性結(jié)腸炎的臨床觀察[J].中國藥房, 2017,28(05)∶629-632.

[10]徐俊燕,吳建業(yè).美沙拉嗪聯(lián)合雙歧桿菌四聯(lián)活菌片對潰瘍性結(jié)腸炎患者脂質(zhì)過氧化損傷保護作用的觀察[J].藥物流行病學(xué)雜志,2015(12)∶712-714.

[11]S ingh N,G u r a v A,S i v a p r a k asa m S,e t a l.A ct i v a t ion o f Gp r109a,r e c e p t o r f o r nia c in an d t he c o mm ensa l m e t a b o l i t e b u t y r a t e,s u pp r esses c o l oni c in f l a mm a t ion an d c a rc inogenesis[J]. I mm u ni t y,2014,40(01)∶128-39.

[12]F u k u d a S,H i d ehi r o T oh,K o j i H ase,e t a l.B i f i d o b a ct e r ia c an p r o t e ct f r o m en t e r o p a t hogeni c in f e ct ion t h r o u gh p r o d u ct ion o f a c e t a t e[J].N a t u r e,2011.

R574.62

A

10.14025/j.cnki.jlny.2017.13.016

郭慧慧，在讀碩士研究生，研究方向：微生物資源開發(fā)與利用。

宋慧，博士，教授，研究方向：生物大分子結(jié)構(gòu)與功能。

項目名稱：M IMBb75菌株動物學(xué)試驗研究；標注：橫向聯(lián)合項目，與吉林大學(xué)白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠