HPLC法同時測定祛瘀止痛合劑中6種成分的含量Δ

李潔環，王洛臨，郭鳴，徐文杰，陳雪婷，李智勇（1.廣州中醫藥大學附屬廣東第二中醫院，廣州510405；.廣東省中醫藥工程技術研究院/廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣州510095）

HPLC法同時測定祛瘀止痛合劑中6種成分的含量Δ

李潔環1，2＊，王洛臨2#，郭鳴1，2，徐文杰2，陳雪婷2，李智勇2（1.廣州中醫藥大學附屬廣東第二中醫院，廣州510405；2.廣東省中醫藥工程技術研究院/廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣州510095）

目的：建立同時測定祛瘀止痛合劑中芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Waters Xbridge C18，流動相為0.1%磷酸-乙腈（梯度洗脫），流速為1.0m L/m in，檢測波長為203 nm，柱溫為20℃，進樣量為5μL。結果：芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1檢測進樣量線性范圍分別為0.273 4～2.734μg（r＝0.999 9）、0.119 1～1.191μg（r＝0.999 9）、0.081 5～0.815μg（r＝0.999 9）、0.622 8～6.228μg（r＝0.999 9）、0.807 2～8.072μg（r＝0.999 9）、1.036 4～10.364μg（r＝0.999 9）；定量限分別為0.082 0、0.029 8、0.028 5、0.436 0、0.403 6、0.310 9μg，檢測限分別為0.027 9、0.009 5、0.010 2、0.124 6、0.121 1、0.093 3μg；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為97.85%～100.34%（RSD＝0.81%，n＝6）、98.14%～101.22%（RSD＝1.09%，n＝6）、98.42%～102.15%（RSD＝1.29%，n＝6）、97.77%～100.25%（RSD＝0.96%，n＝6）、97.32%～99.53%（RSD＝0.81%，n＝6）、98.28%～101.51%（RSD＝1.11%，n＝6）。結論：該方法簡便快速、穩定可行、重復性好，可用于祛瘀止痛合劑中6種成分含量的同時測定。

高效液相色譜法；祛瘀止痛合劑；芍藥苷；柚皮苷；新橙皮苷；三七皂苷R1；人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb1

祛瘀止痛合劑是廣州中醫藥大學附屬廣東第二中醫院的臨床經驗方，由三七、枳殼、白芍、川芎等藥材組成，具有活血止痛、行氣活絡、祛瘀消腫之功效，臨床上用于治療骨折早期由于氣血阻滯而導致的瘀血腫脹。研究表明，三七中皂苷類成分能降低血液黏度、抑制血小板聚集、改善微循環，是活血的主要成分[1-2]。白芍中芍藥苷具有鎮痛解痙、改善血流變、抑制血小板凝集等作用[3-4]。枳殼中柚皮苷具有鎮痛抗炎作用，還能促進成骨細胞的生成，增強骨更新[5]；新橙皮苷能抑制毛細血管脆性，恢復損傷所致的紫斑[6-8]。中藥復方制劑組成復雜、成分眾多，但目前對該制劑的研究多采用單一成分的含量測定來進行質量監測，不能全面反映其質量。因此，本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定祛瘀止痛合劑中芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量的方法，以期為完善該制劑的質量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC儀，包括G1322A紫外檢測器、G1322A標準真空脫氣機、G1312A二元泵、G1329A標準自動進樣器、G1316A標準柱溫箱、Agilent Chemstation B 03.01色譜工作站（美國Agilent公司）；JJ500型電子分析天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；FE20型pH計、ME204型電子分析天平均購自瑞士M ettler-Toledo公司；KQ-300DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：300W，頻率：40 kHz）；M illi-Q Advantage A10型超純水系統（美國M illipore公司）；T-50型溶劑過濾器（天津市津騰實驗設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

祛瘀止痛合劑（廣州中醫藥大學附屬廣東第二中醫院自制，批號：160301、160302、160303，規格：150m L/瓶）；芍藥苷對照品（批號：110736-201640，純度：95.2%）、柚皮苷對照品（批號：110722-201312，純度：94.7%）、新橙皮苷對照品（批號：111857-201102，純度：99.6%）、三七皂苷R1對照品（批號：110745-201318，純度：94.0%）、人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-201128，純度：93.4%）、人參皂苷Rb1對照品（批號：110704-201223，純度：95.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～12 min，15%B；12～60 m in，15%→36%B）；流速：1.0 m L/m in；檢測波長：203 nm；柱溫：20℃；進樣量：5μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液取芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1對照品各適量，精密稱定，置于同一10m L量瓶中，加甲醇溶解，制成上述各待測成分質量濃度分別為0.546 8、0.238 2、0.163 0、1.245 6、1.614 4、2.072 8mg/m L的混合對照品貯備液。精密量取上述混合對照品貯備液適量，置于2m L量瓶中，加甲醇稀釋，制成上述各待測成分質量濃度分別為0.273 4、0.119 1、0.081 5、0.622 8、0.807 2、1.036 4mg/m L的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液精密量取樣品0.3m L，置于10m L量瓶中，加甲醇適量，超聲處理25m in，放冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液按祛瘀止痛合劑的處方比例和制備工藝制備缺白芍、枳殼和三七的單一陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備缺白芍、枳殼和三七的單一陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，理論板數以芍藥苷峰計為11 878，保留時間為11.801m in；各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5。結果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram s

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品貯備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m L，分別置于1m L量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各5μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分進樣量為橫坐標（x，μg）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表1。

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得定量限（LOQ）；當信噪比為3∶1時，得檢測限（LOD）。結果，芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的LOQ分別為0.082 0、0.029 8、0.028 5、0.436 0、0.403 6、0.310 9μg，LOD分別為0.027 9、0.009 5、0.010 2、0.124 6、0.121 1、0.093 3μg。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equationsand linear ranges

2.6 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液5μL，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為0.83%、0.79%、0.92%、1.02%、0.98%、1.13%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

精密吸取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：160301）5 μL，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為0.91%、1.03%、1.15%、0.98%、1.34%、1.22%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

取同一批樣品（批號：160301）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算各待測成分的含量。結果，芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量的平均值分別為1.903 2、0.966 8、0.602 5、5.132 2、13.343 1、9.644 7mg/m L，RSD分別為1.21%、0.89%、0.97%、1.05%、1.18%、1.42%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取樣品（批號：160301）0.15m L，共6份，分別加入一定質量的芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表3。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

本課題組考察了Agilent Eclipse Plus C18、AgilentExtend C18和Waters Xbridge C18色譜柱的分離、洗脫效果，結果，Agilent Eclipse Plus C18和Agilent Extend C18的分離效果均較差，在25～50min內（即柚皮苷、新橙皮苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1的出峰時間段）色譜基線漂移嚴重，而改用Waters Xbridge C18時，各成分分離效果較好，且色譜基線相對平穩。因此，選擇Waters Xbridge C18為本試驗的色譜柱。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Resultsof recovery tests（n＝6）

表3 樣品含量測定結果（n＝3，mg/m L）Tab 3 Resu lts of contents determ ination of sam p les（n＝3，mg/m L）

3.2 檢測波長的選擇

本課題組在預試驗階段采用分段變換波長的方法進行測定，結果，色譜基線漂移嚴重，故考慮選用單波長進行測定。筆者考察了203 nm和283 nm兩個波長，結果選擇283 nm為本試驗的檢測波長時，芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷的色譜峰較高，而三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1色譜峰則較低，與前3個成分相差懸殊；改用203 nm波長進行測定時，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的色譜峰較高，而且其他3個成分的色譜峰也適中，故本試驗確定檢測波長為203 nm。

3.3 柱溫的選擇

筆者曾考察了20、25、30℃3個柱溫對色譜分離效果的影響。結果，柱溫為20℃時，與25℃和30℃相比，新橙皮苷、人參皂苷Rg1的分離度有明顯改善，故確定本試驗的柱溫為20℃。

3.4 流動相的選擇

筆者參考相關報道[9-12]，考察了不同流動相系統及流動相比例對各成分的洗脫效果。結果，用甲醇-水系統進行梯度洗脫時，部分成分未能洗脫出，不適合作為本試驗的流動相；用乙腈-水系統進行梯度洗脫時，各成分雖均被洗脫，但峰形差、有拖尾，改用0.1%磷酸-乙腈作為流動相進行梯度洗脫，并經過多次調整流動相比例，各成分峰形得到改善，且分離度較好，最終本試驗選擇0.1%磷酸-乙腈作為流動相。

綜上所述，本方法簡便快速、穩定可行、重復性好，可用于祛瘀止痛合劑中6種成分含量的同時測定。

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（編輯：劉柳）

SimultaneousDeterm ination of 6 Components in Quyu Zhitong M ixture by HPLC

LIJiehuan1，2，WANG Luolin2，GUO M ing1，2，XUWenjie2，CHEN Xueting2，LIZhiyong2（1.Guangdong Second Chinese Medical Hospital A ffiliated to Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510405，China；2.Guangdong Research Institute of TCM Engineering and Technology/Guangdong Provincial Key Laboratory of TCM Research and Development，Guangzhou 510095，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determ ination of paeoniflorin，naringin，neohesperidin，notoginsenoside R1，ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in Quyu zhitong mixture.METHODS：HPLC method was adopted.The determ ination was performed on Waters Xbridge C18column w ith mobile phase consisted of 0.1%phosphoric acid-acetonitrile（gradient elution）at the flow rate of 1.0 m L/min.The detection wavelength was set at 203 nm，and column temperature was 20℃.The sample size was 5μL.RESULTS：The linear ranges of paeoniflorin，naringin，neohesperidin，notoginsenoside R1，ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1were 0.273 4-2.734μg（r＝0.999 9），0.119 1-1.191μg（r＝0.999 9），0.081 5-0.815μg（r＝0.999 9），0.622 8-6.228 μg（r＝0.999 9），0.807 2-8.072μg（r＝0.999 9），1.036 4-10.364μg（r＝0.999 9）.The limits of quantitation were 0.082 0，0.029 8，0.028 5，0.436 0，0.403 6，0.310 9μg.The lim its of detection were 0.027 9，0.009 5，0.010 2，0.124 6，0.121 1，0.093 3μg.RSDs of precision，stability and reproducibility testswere lower than 2.0%.Recoverieswere 97.85%-100.34%（RSD＝0.81%，n＝6），98.14%-101.22%（RSD＝1.09%，n＝6），98.42%-102.15%（RSD＝1.29%，n＝6），97.77%-100.25%（RSD＝0.96%，n＝6），97.32%-99.53%（RSD＝0.81%，n＝6）and 98.28%-101.51%（RSD＝1.11%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple，rapid，stable，feasible and reproducible，and can be used for the simultaneous determination 6 components in Quyu zhitongmixture.

HPLC；Quyu zhitong m ixture；Paeoniflorin；Naringin；Neohesperidin；Notoginsenoside R1；Ginsenoside Rg1；Ginsenoside Rb1

R 917

A

1001-0408（2017）18-2557-04

2017-01-13

2017-03-17）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.18.31