HPCE法測定金銀花藥材中木犀草苷、槲皮素和金絲桃苷的含量Δ

曾雪，楊元娟，陳竹，唐倩，石磊（.重慶醫(yī)藥高等?？茖W校，重慶4033；.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶40）

HPCE法測定金銀花藥材中木犀草苷、槲皮素和金絲桃苷的含量Δ

曾雪1＊，楊元娟1#，陳竹2，唐倩1，石磊1（1.重慶醫(yī)藥高等?？茖W校，重慶401331；2.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶401121）

目的：建立同時測定金銀花藥材中木犀草苷、槲皮素和金絲桃苷含量的方法。方法：采用高效毛細管電泳法。毛細管柱為石英毛細管柱，檢測波長為360 nm，分離電壓為20 kV，進樣方式為電動進樣，進樣電壓為15 kV，進樣時間為5 s，操作溫度為25℃，緩沖溶液為60mmol/L四硼酸鈉-50mmol/L碳酸鈉-50mmol/L丙羥基-β-環(huán)糊精（pH 9.2）。結(jié)果：木犀草苷、槲皮素和金絲桃苷檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.06～0.56mg/m L（r＝0.988 1）、0.08～0.56mg/m L（r＝0.989 2）、0.06～0.49mg/m L（r＝0.979 6）；精密度、穩(wěn)定性、重復性的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為96.12%～99.77%（RSD＝1.29%，n＝6）、95.90%～98.35%（RSD＝0.89%，n＝6）、94.07%～97.45%（RSD＝1.33%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復性好，可用于金銀花藥材中木犀草苷、槲皮素和金絲桃苷含量的同時測定。

高效毛細管電泳法；木犀草苷；槲皮素；金絲桃苷；金銀花

金銀花Lonicera japonica flos是一種較常見的中藥，又稱忍冬花，其味甘，性寒，具有涼散風熱、清熱解毒、抗炎抑菌的作用[1-2]。金銀花中藥用有效成分以有機酸和黃酮類化合物為主。其中，黃酮類化合物主要包括木犀草苷、槲皮素和金絲桃苷，三者均能抑制腸道的致病菌、抗腫瘤以及抗呼吸道病毒感染[3-4]。目前常用于金銀花有效成分的檢測方法是高效液相色譜法（HPLC）[5-6]，但缺點為操作復雜、試劑消耗量較大。毛細管電泳作為一種高效分離技術(shù)手段，相對于HPLC具有流動相配制簡單、試劑消耗量少、分析速度快等優(yōu)點，常用于有效成分的檢測[7-8]。因此，筆者采用高效毛細管電泳法（HPCE）建立測定金銀花藥材中黃酮類化合物木犀草苷、槲皮素和金絲桃苷含量的方法，旨在為金銀花的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

CL1020型HPCE儀，包括紫外檢測器（北京彩陸儀器有限公司）；SK-1型渦旋混合器（常州市國旺儀器制造有限公司）；KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：200W，頻率：40 kHz）；AUX220型電子分析天平（日本Shimadzu公司）。

1.2 試劑

木犀草苷對照品（批號：A0121，純度：99.0%）、槲皮素對照品（批號：A0114，純度：98.0%）、金絲桃苷對照品（批號：Q0134，純度：98.0%）均購自美侖生物科技有限公司；試驗所用試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

金銀花藥材（重慶太極集團重慶中藥二廠，批號：110912201606、110912201607、110912201608、110912201609、110912201611）經(jīng)筆者鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 電泳條件

毛細管柱：石英毛細管柱（51 cm×67.4 cm×75μm）；檢測波長：360 nm，分離電壓：20 kV；進樣方式：電動進樣；進樣電壓：15 kV；進樣時間：5 s；操作溫度：25℃；緩沖溶液：60 mmol/L四硼酸鈉-50 mmol/L碳酸鈉-50 mmol/L丙羥基-β-環(huán)糊精（pH 9.2）。

2.2 毛細管預(yù)處理

毛細管分別用0.1mol/L氫氧化鈉沖洗活化10min，水洗5min，再用緩沖溶液沖洗5m in。每次進樣前都分別用0.1mol/L氫氧化鈉沖洗3min，水洗1m in，再用緩沖溶液沖洗2min，以保證遷移時間和峰面積的重現(xiàn)性。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液分別精密稱取待測成分對照品10 mg，各置于1.5m L離心管中，加緩沖溶液1m L，渦旋振蕩混勻，40℃下水浴加熱使溶解，制成木犀草苷、金絲桃苷和槲皮素質(zhì)量濃度均為10mg/m L的單一對照品貯備液。臨用前，分別量取上述單一對照品貯備液各20μL，分別置于100μL PCR管中，加緩沖溶液80μL，制成木犀草苷、金絲桃苷和槲皮素質(zhì)量濃度均為2mg/m L的單一對照品溶液[9-10]。

2.3.2 供試品溶液將干燥藥材樣品粉碎，精密稱取藥材樣品粉末約1 g，置于錐形瓶中，加70%甲醇溶液50 m L，稱定質(zhì)量，超聲處理1.5 h，取出，放冷；再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇溶液補充減失的質(zhì)量，濾過；精密吸取濾液1m L，置于10m L量瓶中，加70%甲醇溶液定容，搖勻；經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，既得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.3”項下對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項下電泳條件進樣測定，記錄電泳圖，詳見圖1。結(jié)果，木犀草苷、金絲桃苷和槲皮素均能實現(xiàn)完全分離，且在供試品中上述成分均無干擾組分存在，證明本方法適用于金銀花提取物的含量測定。

2.5 線性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram s

分別精密量取“2.3.1”項下待測成分對照品溶液各1m L，各置于10m L量瓶中，加70%甲醇溶液定容，制成木犀草苷、金絲桃苷和槲皮素質(zhì)量濃度均為0.2mg/ m L的混合對照品溶液。精密量取上述混合對照品溶液0.3、0.8、1.3、1.8、2.3、2.8m L，分別置于10m L量瓶中，加70%甲醇溶液定容，制成系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各10μL，按“2.1”項下電泳條件進樣測定，記錄峰面積。以木犀草苷、金絲桃苷和槲皮素質(zhì)量濃度（x，mg/m L）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得木犀草苷、金絲桃苷和槲皮素回歸方程分別為y＝0.074 11x－0.028 1（r＝0.988 1）、y＝0.082 14x－0.064 3（r＝0.989 2）、y＝0.062 14x－0.014 1（r＝0.979 6）。結(jié)果表明，木犀草苷、金絲桃苷和槲皮素檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.06～0.56、0.08～0.56、0.06～0.49 mg/m L。

2.6 精密度試驗

取“2.3.1”項下待測成分對照品溶液各適量，按“2.1”項下電泳條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，木犀草苷、金絲桃苷和槲皮素峰面積的RSD分別為1.67%、1.91%、1.84%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.3.2”項下供試品溶液（批號：110912201608）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時按“2.1”項下電泳條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，木犀草苷、金絲桃苷和槲皮素峰面積的RSD分別為1.23%、1.41%、1.19%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：110912201608）適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下電泳條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，木犀草苷、金絲桃苷和槲皮素含量的平均值分別為0.381%、0.272%、0.312%，RSD分別為1.39%、1.88%、1.73%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量樣品（批號：110912201608）適量，共6份，分別加一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下電泳條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1 Resultsof recovery tests（n＝6）

2.10 藥材樣品含量測定

取5批藥材樣品各適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下電泳條件進樣測定，記錄峰面積并計算藥材樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 藥材樣品含量測定結(jié)果（n＝3，%）Tab 2 Results of content determ ination of sam p les（n＝3，%）

3 討論

根據(jù)文獻[9-10]，金絲桃苷和槲皮素在360 nm處均有最大吸收，木犀草苷的最大吸收波長在350 nm處，由于本試驗采用的是單紫外檢查器，因此選定360 nm作為系統(tǒng)檢查波長。

在重復性試驗和加樣回收率試驗中筆者發(fā)現(xiàn)，長時間連續(xù)性試驗會導致含量檢測值下降，分析可能是由于連續(xù)的進樣降低了毛細管柱的分離效率，在后期研究中可對毛細管柱進行惰性處理，以保持色譜柱的分離效率。

在加樣回收率試驗和含量測定試驗中，其RSD高于文獻[9]采用的HPLC法，分析原因可能是由于電動進樣方式還不夠準確造成。因為進樣電壓和驅(qū)動電壓采用同一電源，操作中首先需設(shè)定進樣電壓，再改為分離電壓，多樣品操作中，不同樣品的轉(zhuǎn)換時間難以保持一致，導致樣品進樣量可能存在差異，以致RSD相對偏高。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復性好，可用于金銀花藥材中木犀草苷、槲皮素和金絲桃苷含量的同時測定。

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ContentsDetermination of Luteoloside，Quercetin and Hyperoside in the Extract of Lonicera japonica by HPCE

ZENG Xue1，YANG Yuanjuan1，CHEN Zhu2，TANG Qian1，SHI Lei1（1.Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 401331，China；2.Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China）

OBJECTIVE：To establish amethod for contents determination of luteoloside，quercetin and hyperoside in Lonicera japonica.METHODS：HPCE was performed silica capillary column w ith detection wavelength of 360 nm and separation voltage of 20 kV，electrokinetic sampling，sampling voltage of 15 kV，sampling time of 5 s，operation temperature of 25℃.The buffer was consisted of 60 mmol/L sodium tetraborate-50 mmol/L natrium carbonicum-50 mmol/L hydroxypropyl-β-cyclodextrin（pH 9.2）. RESULTS：The linear rangesof luteoloside，quercetin and hyperosidewere 0.06-0.56mg/m L（r＝0.988 1），0.08-0.56mg/m L（r＝0.989 2），0.06-0.49 mg/m L（r＝0.979 6），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoverieswere 96.12%-99.77%（RSD＝1.29%，n＝6），95.90%-98.35%（RSD＝0.89%，n＝6），94.07%-97.45%（RSD＝1.33%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，stable and reproducible，and can be used for simultaneous determ ination of luteoloside，quercetin and hyperoside in L.japonica.

HPCE；Luteoloside；Quercetin；Hyperoside；Lonicera japonica

R927

A

1001-0408（2017）18-2543-03 DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.18.27

2016-12-24

2017-01-20）

（編輯：張靜）

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃項目（No.cstc2014jcyjA10125）；重慶醫(yī)學檢驗試劑研究所科技創(chuàng)新項目（No.CQYJS1502）；重慶市衛(wèi)計委中醫(yī)藥科技項目（No.2012-2-17）；重慶市教委科學技術(shù)研究項目（No.KJ132501）

＊講師，博士。研究方向：中藥提取及藥物分析。E-mail：13108918885@163.com

#通信作者：教授，碩士。研究方向：藥物分析。E-mail：1210719517@qq.com