少棘蜈蚣候選毒素多肽κ-SLPTX-Ssm1b的原核表達與純化

吳茜，吳慧，吳磊，孟爾

（國防科學技術大學理學院生物信息研究中心，湖南長沙410073）

少棘蜈蚣候選毒素多肽κ-SLPTX-Ssm1b的原核表達與純化

吳茜，吳慧，吳磊，孟爾*

（國防科學技術大學理學院生物信息研究中心，湖南長沙410073）

κ-SLPTX-Ssm1b是從少棘蜈蚣的cDNA文庫中獲得的一類功能未知的毒素，它與鉀通道抑制劑κ-SLPTX-Ssm1a高度同源，由50個氨基酸殘基構成，含有3對二硫鍵的多肽分子.利用pET-43-His-SUMO原核表達載體，通過E.coli SHuffleTM菌種自動誘導表達，隨后利用鎳柱和RP-HPLC純化，并通過MALDI-TOF質譜鑒定其分子量為5532.1870 Da，與理論值5532.3 Da相符.其產量為1 mg/L，為進一步鑒定其電生理活性奠定了基礎.

原核表達；少棘蜈蚣；蛋白純化；E.coli SHuffleTM

電壓門控鉀通道（voltage-gated K+channels，Kv）是細胞膜上鉀離子通道的重要組成部分，可分為許多種類，功能不盡相同，對應的病變也會導致多種多樣的疾病，例如神經麻痹、糖尿病、腫瘤增殖等[2-3].因此，對Kv通道的研究能夠促進現代醫學的發展，為進一步開發的相關藥物提供理論研究基礎.蝎子、蜘蛛、蜈蚣等有毒動物的毒素是電壓門控離子通道靶向藥物的重要來源.動物毒素可作用于受體和通道，且作用的靈敏性極高、選擇性極高，具有極高的成藥率[4-6].有不少研究表明，動物毒素可以作用于多種細胞膜的離子通道[7-8]，并且對細菌、真菌等微生物有非常強效的殺滅作用[9-10].這些毒素可以作為研究工具來研究人類的生理機制.例如少棘蜈蚣毒液的毒素κ-SLPTX-Ssm4a、?？舅豐hK-192均可專一結合并抑制淋巴細胞中廣泛分布的Kv1.3通道，后者可用于治療自身免疫疾病，目前正在臨床試驗階段[11-12].另一種少棘蜈蚣毒腺的毒素κ-SLPTX-Ssm1a在1 μm的低濃度下即可完全抑制大鼠背神經節中的鉀通道電流[13]，也是一種潛在的神經藥物.

κ-SLPTX-Ssm1b（以下簡稱κ1b）是產自少棘蜈蚣（Scoropendra subspinipes mutilans）的毒素，是其cDNA文庫中未被研究的毒素多肽，存在三對二硫鍵.毒素κ-SLPTX-Ssm1a（以下簡稱κ1a）與κ1b的序列高度同源，存在有相同位置的三對二硫鍵[13]，因此與κ1b可能存在有類似的空間結構和相似的生理活性.本文使用大腸桿菌SHuffleTM菌株作為受體菌，其優勢在于可表達富含二硫鍵的多肽，有利于這類多肽的正確折疊.文章中使用pET-43a（+）作為原核表達載體，在T7啟動子后面有His標簽，使得重組蛋白可以被鎳柱吸附，從而達到純化的作用.His標簽后、在毒素序列前加入SUMO標簽，不僅可以提高毒素的可溶性[14-15]，還可以通過SUMO激酶（ULP1）切除標簽，進一步通過反相高效液相色譜（RP-HPLC）純化得到完整的κ1b毒素，從而避免了該多肽富含二硫鍵可溶性較差，易形成包涵體的問題[16].最終，4 mL培養基表達后分離純化得到4 mgκ1b毒素，產量為1 mg/L，得到的純化后毒素為后續電生理活性檢測及藥物研究打下了基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

E.coli DH5α菌種和KODFXPCR酶體系購于日本東洋紡，E.coli SHuffleTM菌株菌種購于美國紐英倫生物技術公司，pET-43a（+）載體購于Novagen公司，BDS HYPERSILC18柱、蛋白質分子量標準和DpnI酶體系購于賽默飛世爾科技公司.DNA純化回收試劑盒與質粒小提試劑盒由天根生化科技（北京）有限公司提供.DNA序列和引物合成以及其余試劑均生工生物工程（上海）股份有限公司提供.ULP1激酶由實驗室自制.

1.2 重組表達載體pET-43-His-SUMO-κ1b的構建

從NCBI數據庫中下載κ1b序列（UniProt蛋白接收號：251420），根據E.coli strain K12密碼子偏好性，JCat軟件（http：//www.jcat.de/）優化得到DNA序列為GCTAACGATAAACCAATCGGTAAATGTGGTGATGCTA AACGTAACAAACCATGTCTGGCTTGTTCTCACCGTTCT TCTATCGCTGATTTCTACTCTAAATGTTGTACCTACGA TGCTGTTTACAACGGTTGTCTGGATAAACTGCGTCAC，并送到公司進行合成.根據RF-cloning（Restriction Free cloning）[17]引物設計原則，設計上下游引物分別為κ1b-F：GCTCACCGTGAACAGATCGGTGGTGCTAACGATAA ACCAATCGGT，κ1b-R：GATGGTACCGTCGACGTCCTG CAGTTAGTGACGCAGTTTATCCAGAC.在κ1b之后加入終止密碼子TAA.通過RF-cloning將κ1b的DNA序列插入到改造后的pET-43a（+）載體的SUMO標簽序列之后.PCR產物通過純化回收試劑盒回收后用DnpI酶進行消化，后轉入大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆提取質粒并測序.

1.3 κ1b的表達與純化

將測序正確的重組質粒轉化進SHuffleTM菌株，在LB平板（含100 μg/mL氨芐青霉素）37℃培養過夜.挑取單克隆接種于3 mLZYM-505培養基（含100 μg/mL氨芐青霉素），置于37℃搖床以220 rpm轉速搖菌8 h，隨后以1：1000的比例吸取500 μL菌液接種于500 mL ZYM-5051培養基（含100 μg/mL氨芐青霉素），在搖床中以30℃，220 rpm培養16 h.4000 rmp，15 min離心收集細菌后用1M磷酸緩沖液（PBS）重懸細菌（每500 mL菌液用100 mLPBS），均質機破碎后離心收集上清.上清過Ni-NTA柱，以200 mM咪唑洗脫.洗脫液以10KD超濾管進行超濾，隨后以ULP1激酶4℃過夜酶切.酶切后樣品以0.45 μm濾頭過濾，13 000 rpm離心5 min后，以H2O（0.1%TFA）/乙腈（0.1%TFA）為流動相，用C18反相純化柱（4.6×250 mm，5 μm）進行反相液相色譜，流速1 mL/min進行梯度洗脫，收集紫外光215 nm吸收下單峰樣品，凍干.

1.4 κ1b的MALDI-TOF/TOF質譜鑒定

反相高效液相色譜分離純化所收集的單峰樣品采用MALDI-TOF/TOF進行檢測.去離子水溶解凍干后樣品，分別取1 μL樣品與1 μL基質CCA（α-Cyano -4-hydroxycinnamic acid）的飽和液（由0.1%TFA-50%乙腈-49.9%去離子水配置）混合，再取0.5 μL混合液點樣于樣品盤，室溫干燥后檢測樣品的分子量.

圖1 重組質粒的構建

2 實驗結果

2.1 重組表達質粒pET-43-His-SUMO-κ1b的構建

通過SOE-PCR技術將目的片段κ1b成功插入到載體上，其緊接于SUMO標簽的DNA序列之后，位于His標簽的框架內.使用DnpI酶消化后的PCR產物轉化進DH5α過夜培養，挑取陽性單克隆進行菌落PCR.引物為F：GTCTGGCTTGTTCTCACCGTT，R：CACCACCAC CACCACTAATGTTAATT.PCR產物瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示，有一條很亮的條帶大小約為400 bp，與預期結果一致，證明該基因插入到表達載體上.挑取陽性克隆提取質粒測序結果也與目的片段DNA序列一致，說明表達載體構建成功.

圖2 κ1b的誘導表達與純化SDS-PAGE圖

圖3 κ1b的RP-HPLC純化圖

2.2 κ1b的表達與Ni柱純化

重組質粒轉化進SHuffleTM菌株進行培養，分別收集ZYM-505培養基培養8 h后菌液、ZYM-5051培養基16 h后菌液、菌體破碎離心后沉淀和上清液、過兩遍Ni柱后流穿液、PBS洗脫液（含50 mM咪唑）、PBS洗脫液（含200 mM咪唑）、10 kDa超濾管超濾后內管液、ULP1激酶酶切液進行SDS-PAGE電泳，結果見圖2.由圖2可知，在28 kDa左右大小處，ZYM-5051誘導后比未誘導時多出一條明顯的條帶，與融合蛋白大小相符，說明目的蛋白誘導表達成功.由泳道3和4可知，融合蛋白存在于上清液中，可溶性好.過Ni柱兩次后融合蛋白絕大多數已掛柱，50 mM咪唑洗脫下多數與Ni柱非親和結合的雜蛋白，融合蛋白在200 mM咪唑濃度下被洗脫.泳道9顯示，融合蛋白酶切成功，多出一條3~6 kDa大小的條帶，與目的蛋白κ1b大小5532.3 Da一致.

2.3 κ1b的RP-HPLC純化與MALDI-TOF/TOF質譜鑒定

酶切產物通過反相液相色譜進行進一步分離純化.以50 min的溶液梯度線性洗脫，乙腈濃度由15%梯度變化至65%.收集215 nm紫外光波長檢測下單峰進行凍干后質譜鑒定，結果見圖3.圖3a所示目的峰在18.5 min左右出現，此時乙腈濃度約為23%.凍干后樣品以水溶解，通過反相液相色譜進行二次純化.圖3b顯示梯度洗脫下僅有一個單峰，圖3b顯示凍干后進行SDS-PAGE電泳分析，僅有一個條帶在6 kDa左右.圖4b所示的質譜結果5 532.1870 Da與理論值5532.3 Da相符，說明制備所得目的蛋白κ1b純度較高.其產量為1.0 mg/L.

圖4 κ1b的質譜鑒定分析圖

3 結果與討論

電壓門控鉀通道廣泛分布于哺乳動物多種細胞的細胞膜上，在有機體中參與了許多重要的生理功能，如細胞膜興奮性，神經去極化等.同時它的病變也會引發許多的疾病，包括難以治愈的腫瘤、糖尿病等熱點疾病.因此，鉀通道藥物的開發顯得極其重要.研究發現，蜈蚣等有毒動物毒腺是離子通道活性多肽的重要來源.并且動物毒素成藥率高，已有多種離子通道靶向毒素多肽來源藥物上市或處于臨床試驗階段，因此從蜈蚣毒腺中分離具有藥用價值的毒素多肽十分必要.

本文選取了與對鉀通道電流有抑制作用的毒素κ1a同源性高且未知活性的毒素κ1b，由于毒素κ1a對鉀離子通道的抑制作用，因此對該毒素的研究對于篩選獲得鉀通道活性多肽毒素顯得尤為重要.獲得大量κ1b毒素的方法有多種，如直接分離、化學合成，異源表達等.本文選用在利于富含二硫鍵多肽正確折疊的菌株E. coli SHuffleTM中表達，使得大量獲得該毒素成本較低且易大量生產.避免了從蜈蚣毒腺直接分離毒素所得量少且過程繁瑣的缺陷以及使用化學合成使得復性困難而難以形成正確的有活性的結構的缺陷.通過構建His-SUMO-κ1b的表達載體在E.coli SHuffleTM菌株中來融合表達毒素κ1b.ULP1激酶可以識別并切割SUMO標簽獲得初步純化的κ1b毒素多肽.經過反相高效液相色譜純化獲得高純度的κ1b毒素多肽質譜鑒定確定正確且純度達到后續生理活性試驗的要求.本文的研究為后續的κ1b的電生理活性檢測試驗起了重要的作用，也為將來更多的為將來富含二硫鍵毒素的原核表達奠定了基礎.

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Prokaryotic Expression and Purification of κ-SLPTX-Ssm1b，a Candidate of Toxin from Centipede Scolopendra Subspinipes Mutilans

WU Xi，WU Hui，WU Lei，MENG Er*
（Research Center of Biological Information，National University of Defense Technology，Changsha，Hunan 410073）

The κ-SLPTX-Ssm1b is a class of unknown toxins obtained from the cDNA library of the the centipede Scolopendra subspinipes mutilans，which is highly homologous to the potassium channel inhibitor，κ-SLPTX-Ssm1a.It consists 50 amino acid residues and 3 disulfide bonds.The coding sequence was obtained by gene synthesis after codon optimization and was inserted to an expression vector pET-43-His-SUMO expressed with auto-induction method in the cytoplasm of E.coli strain SHuffleTM.And it was then purified by Ni-NTA column and RP-HPLC.The molecular weight was 5532.1870 Da by MALDI-TOF mass spectrometry，with consistent of the theoretical value，5532.3 Da.The yield of expression is 1 mg/L，which lays the foundation for the identification of its electrophysiological activity.

prokaryotic expression；scolopendra subspinipes mutilans；protein purification；E.coli SHuffleTM

Q812

A

1671－9743（2017）05－0062－05

2017-04-02

國防科學技術大學校預研“離子通道抑制因子的作用機制”（JC13-02-16）.

吳茜，1994年生，女，湖北天門人，碩士研究生，研究方向：生物效應；

*通訊作者：孟爾，1983年生，湖南長沙人，講師，博士，研究方向：生物效應.